Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류
Summary
산호는 인간과 해양 생물 모두에게 중요한 생물 다양성 생태계를 만듭니다. 그러나, 우리는 아직도 많은 산호 세포의 완전한 잠재력과 기능을 이해하지 못합니다. 여기에서, 우리는 돌로 된 산호 세포 인구의 격리, 표지 및 분리를 위해 개발된 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
산호초는 인위적 스트레스로 인해 위협을 받고 있습니다. 이러한 스트레스에 산호의 생물학적 반응은 세포 수준에서 발생할 수 있습니다,하지만 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다. 스트레스에 산호 응답을 조사 하려면, 우리는 세포 응답을 분석 하기 위한 도구가 필요. 특히, 우리는 세포 집단이 스트레스에 반응하는 방법을 더 잘 이해하기 위하여 기능적인 측정법의 응용을 촉진하는 공구가 필요합니다. 현재 연구에서는, 우리는 돌산호에 있는 다른 세포 인구를 격리하고 분리하기 위하여 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 이용합니다. 이 프로토콜은 다음을 포함한다: (1) 골격으로부터 산호 조직의 분리, (2) 단일 세포 현탁액의 생성, (3) 유세포 측정을 위한 다양한 마커를 사용하여 산호 세포를 표지하는 것, 및 (4) 게이팅 및 세포 선별 전략. 이 방법은 연구원이 분석, 기능 분석 및 다른 세포 집단의 유전자 발현 연구를 위한 세포 수준에서 산호에 작동하도록 가능하게 할 것입니다.
Introduction
산호초는 지구상에서 가장 중요한 생태계 중 하나입니다. 그들은 물고기와 무척추 동물에 대한 중요한 서식지를 제공함으로써 생물 다양성을 촉진하고 관광1을통해 음식과 경제적 생계를 제공함으로써 인류 공동체를 유지하는 데 중요합니다. 산호초의 주요 빌더인 산호동물(Phylum: Cnidaria)은 파도와 폭풍 피해를 완화하는 대형 탄산칼슘 프레임워크를 만들어 해안 지역사회를 돕습니다2.
산호는 성인으로서 바이러스, 고고학, 박테리아, 프로티스트, 곰팡이, 그리고 특히 조류 디노플라젤레이트 패밀리 심비오디니아과3의구성원을 포함하는 다양한 내분비파트너를 호스트하는 세실 동물이다. 환경의 변화는 종종 질병 발발과 공생 Symbiodiniaceae따라서 산호 식민지에서 추방되는 산호 표백으로 이어지는이 지역 사회에서 불균형을 일으킬 수 있습니다, 따라서 산호에 대한 영양의 주요 소스를 제거. 이 두 가지 시나리오는 종종산호 호스트4,5,,6의죽음을 일으킵니다. 급속한 기후 변화와 같은 인위적인 유발 스트레스의 영향은 대량 산호 사멸 사건을 가속화하여 산호초의 세계적인 쇠퇴로 이어지고 있습니다7.
최근에는 산호초 손실을 완화하기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법은 기존 산호초에 산호의 식재, 열 내성 유전형을 사용하여 유전 횡단, 산호 내에서 호스팅 미생물 및 공생 지역 사회의 세포조작을포함8,9. 이러한 노력에도 불구하고, 산호세포의 다양성과세포기능(10,,11,,12,,13)에대해서는 아직 알려지지 않은 것들이 많다. 산호 세포 유형 다양성과 세포 기능에 대한 철저한 이해는 산호 유기체가 규범적이고 스트레스가 많은 조건에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 필요합니다. 복원 및 보존 효율성을 극대화하기 위한 노력은 세포 다양성과 유전자 기능이 결합되는 방식에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 것입니다.
세포 다양성 및 기능에 대한 이전 연구는 주로 조직학 연구 및 전체 조직 RNA 샘플링14,,15,,16,,17에초점을 맞추고 있다. 산호의 특정 세포 유형 기능에 대한 자세한 내용을 얻으려면, 살아있는 산호 세포의 특정 인구의 격리를위한 방법이 있을 필요가있다. 이는 형광 활성화 세포 선별(FACS) 유세포 분석 기술18에의해 비고전적 모델 유기체에서 성공적으로 수행되었다. FACS는 상대적인 세포 크기, 세포 세분성 및 자동 형광과 같은 단일 세포 수준에서 다른 내인성 세포 특성을 측정하기 위해 다양한 파장으로 조정된 레이저의 조합을 이용합니다. 부가적으로, 세포는 특정, 원하는 특성 을 측정하기 위해 형광 표지 화합물에 의해 표시 될 수있다18,,19.
지금까지 산호세포에 대한 유세포분석의 적용은 주로 그들의 강하고 자연적인자가형광(20,,21,,22)을이용하여 공생공생과 및 기타 세균 집단의 분석을 위한 것이되었다. FACS는 또한 참조 모델 유기체 세포23,,24에비해 형광 DNA 마커 신호를 사용하여 산호 게놈 크기를 추정하는 데 사용되어 왔다. FACS의 효율적인 응용 프로그램은 세포 생물학 연구에 유용한 세 가지 뚜렷한 도구를 제공합니다 : 1) 단일 세포의 형태학적 및 기능적 설명; 2) 다운스트림 연구를 위한 특정 세포 집단의 식별, 분리 및 격리; 및 3) 단일 세포 수준에서 기능성 분석의 분석.
산호 세포의 연구를위한 다양한 외인성 형광 마커의 개발 및 적용은 거의 탐험되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이러한 마커는 태그가 지정된 단백질, 효소에 대한 태그가 지정된 기질, 또는 다른 화합물에 대한 형광 반응을 포함할 수 있다. 이 마커는 리소좀같이 특정 세포 구획 특징의 다양한 양을 생성하는 세포를 강조하는 것과 같은 독특한 특성이 있는 세포 모형을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 추가적인 예는 형광표지된 비드를 사용하여 식세포증또는 표적병원균(25)의침형성에 유능한 세포를 기능적으로 식별한다. 면역 반응에서 활성 세포의 집단은 외인성 적용 비드의 침몰 후 FACS에 의해 쉽게 식별 될 수있다. 전통적인 조직학적 방법은 비드 침윤에 대해 양성 세포의 백분율을 근사하기 위해 보존 된 조직과 많은 시간을 필요로하지만, 병원체 침윤에 대한 FACS 기반 기능 분석법은 고립 된 살아있는 세포에서 상대적으로 빠르게 수행 될 수 있습니다. 이 기술은 스트레스에 대한 세포 특이적 반응을 연구하는 것 외에도 유전자 특이적 발현을 명확히 하고 칼리코블라스트 및 자각세포와 같은 세포체에 완전히 고유한 세포 유형의 진화 및 발달 역사를 조명할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
최근에는 30개 이상의 세포 마커를 집중적으로 선별하여 산호 세포에 라벨을 붙일 수 있는 24개의 세포를 식별했으며, 그 중 16개는 고유 집단18을구별하는 데 유용하며, 이를 차별화(CD)의 클러스터로 만들었습니다. 여기에서 우리는 POCILlopora damicornis에 있는 산호 세포 격리의 프로세스를 FACS를 가진 특정 세포 인구의 확인 그리고 격리에 탄산칼슘 골격에서 세포를 제거하기에서 기술합니다(그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 Rosental 외18에서 적응하고 P. 다미코니스 세포의 식별 및 격리를 위해 개발되었다. 이 방법론은 상대적인 세포 크기, 상대세포 세분성, 세포 자가형광 및 손상되지 않은 세포막의 존재를 포함한 세포 본질적 인자를 검사를 통해 파편, 생존 불가능한 세포 및 Symbiodiniaceae 호스팅 세포를 제거하기 위해 샘플을 필터링하는 과정에 중점을 둡니다. 이러한 기술은 다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK는이 연구에 자금을 조달하기위한 자연 과학 및 공학 마이애미 연구 상 대학을 인정하고 싶습니다. BR은 비교 및 진화 면역학 실험실에 자금을 지원한 알렉스와 앤 라우터바흐에게 감사를 표하고 싶습니다. BR의 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF) 번호에 의해 지원되었다: 1416/19 및 2841/19, HFSP 연구 보조금, RGY0085/2019. 우리는 기술 지원을 위한 잔나 코제바에바와 마이크 코넬리에게 감사드립니다. 우리는 또한 마이애미 대학, 의학의 밀러 학교의 흐름 세포 분석 공유 자원 에 FACS 세포계에 대한 액세스 및 기술 지원을 섀넌 Saigh에 감사드립니다.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
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