Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi
Summary
Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.
Abstract
Çentik sinyalizasyonu, nöral kök/progenitor hücrelerinin hücre-hücre etkileşimleri tarafından bakımını düzenler. Notch sinyalbileşenleri dinamik bir ifade sergiler. Çentik sinyal efektörü Hes1 ve Notch ligand Delta-like1 (Dll1) nöral kök/progenitor hücrelerinde salınımlı bir şekilde ifade edilir. Bu genlerin salınım lı ekspresyon süresi çok kısa olduğundan (2 saat), döngüsel ekspresyonlarını izlemek zordur. Gen ekspresyonundaki veya protein dinamiğindeki bu kadar hızlı değişimleri incelemek için hızlı yanıt muhabirleri gereklidir. Hızlı olgunlaşma kinetiği ve yüksek duyarlılığı nedeniyle, biyolüminesans muhabiri luciferase canlı hücrelerdeki hızlı gen ekspresyonu değişikliklerini izlemek için uygundur. Organizatör aktivitesini izlemek için dengesi bozulmuş bir luciferase muhabiri ve protein dinamiklerini tek hücre çözünürlükte görselleştirmesi için luciferase-erimiş bir muhabir kullandık. Bu biyolüminesans muhabirleri hızlı ciro göstermek ve çok zayıf sinyaller üretmek; bu nedenle, bu tür silik sinyalleri tespit etmek için son derece hassas bir biyolüminesans görüntüleme sistemi geliştirdik. Bu yöntemler, canlı hücre ve dokularda çeşitli gen ekspresyonu dinamiklerini izlememizi sağlar, bunlar gerçek hücresel durumları anlamamıza yardımcı olacak önemli bilgilerdir.
Introduction
Memeli beyin nöronlar ve glial hücrelerin çeşitli çok sayıda oluşur. Tüm hücreler nöral kök / progenitor hücreleri (NPCs), ilk sayılarını genişletmek için çoğalır, sonra nöronlar içine ayırt etmeye başlar ve nihayet glialhücrelereneden oluşturulur 1,2,3,4,5. Hücreler nöronlara farklılaştıktan sonra çoğalamazlar veya sayılarını artıramazlar ve bu nedenle ndc’lerin daha sonraki aşamalara kadar sürdürülmesi önemlidir. Hücre-hücre etkileşimleri ile çentik sinyal6,7NPCs korunmasında önemli bir rol oynar. Çentik ligandları, komşu hücrelerin yüzeyinde ki membran proteini Çentik ile etkileşime girer ve Çentik proteinini aktive eder. Aktivasyon dan sonra, Notch proteinproteozis oluşur, bu nedenle çekirdekiçinehücre zarından Notch (NICD) hücre içi etki alanı serbest 8,9,10. Çekirdekte NICD, Hes1 ve Hes5 ‘in(Hes1/5)promotör bölgelerine bağlanır ve bu genlerin ekspresyonunu aktive eder. Hes1/5 pronöral genlerin ekspresyonunu bastırmak Ascl1 ve Neurogenin1 (Neurog1/2)11,12,13,14. Pronörgenler nöronal farklılaşmayı indüklediği için, Hes1/5 NP’lerin korunmasında önemli rol oynar. Ayrıca, pronörgenler Notch ligand Delta-like1 (Dll1) ekspresyonunu aktive edebildiği için, Hes1/5 de Dll1ekspresyonunu bastırabilir. Bu nedenle, Dll1 ifadesi Komşu hücrelerin Notch sinyalizasyon yoluyla Dll1 için negatif olmasına yol açar. Bu şekilde, hücreler aynı kaderi takip komşu hücreleri inhibe, lateral inhibisyon olarak bilinen bir fenomen8. Gelişmekte olan beyinde, lateral inhibisyon çeşitli farklı hücre tipleri üreten bir rol oynar.
Tek hücre düzeyinde gerçek zamanlı görüntüleme NPCs15,16,17Çentik sinyal bileşenlerinin dinamik ifadeler ortaya koymaktadır. Çentik sinyalhes1ifadesini aktive eder , ama Hes1 protein kendi organizatörü bağlanır ve kendi ifadesini bastırır. Ayrıca, Hes1 son derece kararsız bir proteindir, bu ubikitin-proteozom yolu tarafından bozulur; bu nedenle, kendi organizatörü baskı sadece kısa ömürlü ve daha sonra transkripsiyon tekrar başlar. Bu şekilde, Hes1 ifadesi 2 h döngüsü18hem transkripsiyon ve çeviri düzeylerinde salınımlar . Hes1 salınımlı ekspresyonu, sırayla, ascl1 gibi downstream hedef genlerin salınım ekspresyonu indükler, Ascl1gibi , Neurog2, ve Dll1, periyodik baskı yoluyla15,16,17,19. Pronör genler nöronal farklılaşmaya neden olabilirken, salınımlı ekspresyonları nöronal farklılaşma için yeterli değildir; yerine onların sürekli ifade nöronal farklılaşma için gereklidir. Pronör genlerin salınımlı ekspresyonu nöronal farklılaşma yı neden olmaktan ziyade NCD’lerin korunması için önemlidir14,15,16. Dll1 ekspresyonu nörogenez ve somitogenez gibi çeşitli morfogenez sırasında hem transkripsiyon hem de çeviri düzeyinde salınım lar. Dll1 dinamik ekspresyonu normal morfogenez ve Dll1 sürekli ekspresyonu için önemlidir nörogenez ve somitogenez17kusurları indükler. Bu bulgular, gen ekspresyonu ve protein kinetik dinamiklerinin çeşitli gelişimsel olayların düzenlenmesi nde sahip olduğu önemli işlevi göstermektedir (örneğin, farklı ifade dinamiği hücresel davranışlarda farklı çıkışlar üretir).
Çentik sinyalleme dinamiklerini analiz etmek için doku ve hücrelerin statik analizi sürekli değiştiği için yetersizdir. Tek hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme gen ekspresyonundaki dinamikleri ortaya çıkarmak için güçlü bir araçtır. Çentik sinyal moleküllerinin dinamik ekspresyonu 2-3 saat süre içinde hızlı döngüsel tepkilere uğrar. Bu hızlı periyodik ifade gerçek zamanlı izleme için iki zor sorun sunar: (1) moleküllerin ekspresyonu düşük seviyelere bastırılır ve (2) hızlı ciro hızlı yanıt muhabirleri gerektirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, daha önce bir biyolüminesans gerçek zamanlı görüntüleme yöntemi20geliştirdi. Biyolüminesans muhabiri floresan muhabirlere göre daha yüksek duyarlılığa ve daha kısa olgunlaşma süresine sahip olduğundan, bu strateji canlı hücrelerdeki hızlı dinamikleri izlememizi sağlar. Gerçek zamanlı görselleştirmeyi kullanarak, daha önce düşündüğümüzden daha fazla genin dinamik ifade sergilediğini bulduk. Buna ek olarak, canlı hücrelerde ekspresyon ve protein dinamiklerini gösteren raporların sayısı ve çeşitli biyolojik olaylarda bu dinamiklerin önemi artmıştır, gen ifadelerinde dinamiklerin temel bir rolü düşündüren21,22.
Bu raporda, notch ligand Dll1’in npt’lerde hem ayrıştırılmış kültürlerde hem de kortikal dilim kültürlerinde ifadesini görselleştirmenin bir yolunu açıklıyoruz. Dll1 transkripsiyonunun dinamiklerini tek hücre seviyelerinde izlemek için, dll1 organizatörü güdümlü dengesiz luciferase muhabiri pDll1-Ub-Fluc muhabiri nitransgenik farelerin embriyonik telensefalonundan elde edilen ndc’lerin ayrıştırılmış kültürlerini oluşturduk. Dll1 protein dinamiklerini vivo olarak izlemek için, Dll1-Fluc füzyon muhabirini korteksteki NPC’lere tanıttık ve kortikal dilim kültürlerinde NPC’lerde muhabirin ifadesini görselleştirdik. Gerçek zamanlı görüntüleme, yüksek zamansal çözünürlükte canlı hücrelerdeki gen ekspresyonu ve protein dinamiğinin çeşitli özelliklerini yakalamamızı sağladı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notch sinyalin bileşenleri somitogenez sırasında senkronize ama nörogenez sırasında senkronize salınımlı ifadeler göstermek, ikinci durumda statik analiz ile ifade dinamikleri yakalama zorluklara yol açan. Bu nedenle, Hes1 ve Dll1gibi Çentik sinyal bileşenlerinin ifade dinamiklerini ortaya çıkarmak için gerçek zamanlı izleme gereklidir. Hes1 ve Dll1 salınımlarının ifadeleri dönemleri son derece kısa olduğundan, ifade dinamiklerini izlemek için yaklaşık 2-3 s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yumiko Iwamoto’ya videonun yapımını desteklediği için teşekkür ederiz. Biz de tartışma ve görüntü analizi destekler için Akihiro Isomura için müteşekkiriz, Hitoshi Miyachi transgenik hayvanların üretimi için teknik destekler için, Yuji Shinjo (Olympus Tıp Bilimi), Masatoshi Egawa (Tıp Bilimi), Takuya Ishizu ( Olympus Tıp Bilimi) ve Ouin Kunitaki (Andor Japonya) biyolüminesans görüntüleme sisteminin teknik destek ve tartışmaları için. Bu çalışma Evrimsel Bilim ve Teknoloji Için Çekirdek Araştırma (JPMJCR12W2) (R.K.), Yenilikçi Alanlar Bilimsel Araştırma Hibe(MEXT 24116705 H.S. ve MEXT 16H06480 R.K.), Grant-in-Aid Bilimsel Araştırma (C) (JSPS) tarafından desteklenmiştir 18K06254) (H.S.), Takeda Vakfı (R.K. ve H.S.) ve Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı,Japonya’dan Yaşam Sistemine Dinamik Yaklaşımlar Platformu.
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
- Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
- Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
- Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
- Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
- Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
- Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
- Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
- Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
- Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
- Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).
