أساليب الثقافة لتحديد الحد من الكشف والبقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام النقل من Campylobacter Jejuni في عينات البراز البشري

Summary

على الرغم من أن ثقافة البراز لCampylobacter غير دقيقة ، إلا أنها لا تزال تعتبر المعيار الذهبي لتحديد الهوية. يتم وصف طرق تحديد الحد من الكشف والبقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام النقل من C. jejuni في البراز البشري ومقارنتها مع المناعة الجديدة مع دقة أفضل.

Abstract

ثقافة من البراز البشري لتشخيص مرض الأمعاء القائم على Campylobacterيستغرق عدة أيام ، وهو الانتظار الذي يدفع الثبات من الطبيب والمريض. الثقافة هي أيضا عرضة لنتائج سلبية كاذبة من فقدان عشوائي من القدرة على البقاء أثناء التعامل مع العينة، وفرط نمو النباتات البرازية الأخرى، وضعف نمو العديد من الأنواع الكابيلاكت المسببة للأمراض على وسائل الإعلام التقليدية. هذه المشاكل يمكن أن تربك القرارات السريرية بشأن علاج المريض وحدّت من المجال من الإجابة على الأسئلة الأساسية حول نمو كامبيلوباكتر والعدوى. نحن نصف الإجراء الذي يقدر الحد الأدنى من الأرقام البكتيرية التي يمكن الكشف عنها من قبل ثقافة وطريقة لقياس البقاء على قيد الحياة من C. jejuni في وسائل الإعلام المستخدمة لنقل هذا الكائن الحي الهش. مع العلم هذه المعلومات، يصبح من الممكن تعيين عتبات الكشف ذات الصلة سريريا لاختبارات التشخيص ومعالجة القضايا غير المدروسة من ما إذا كان الاستعمار غير أعراض هو السائد، إذا كان المشترك مع العدوى مع مسببات الأمراض المعوية الأخرى هو شائع، أو إذا كان الحمل البكتيري يرتبط مع الأعراض أو عواقب خطيرة. وشملت الدراسة أيضا اختبار 1552 عينات البراز المريض التي تم جمعها في المستقبل التي تم تصنيفها في البداية من قبل الثقافة التقليدية ومواصلة اختبارها من قبل المناعة إنزيم جديد. ثم تم فحص العينات الإيجابية وdiscrepant من قبل أربع طرق جزيئية لتعيين حالة إيجابية حقيقية أو سلبية حقيقية. وأظهرت الأساليب الخمس غير الثقافية اتفاقاً كاملاً على جميع العينات الإيجابية والمنسبة البالغ عددها 48 عينة، في حين أخطأت الثقافة في تحديد 14 عينة (28 في المائة). وشملت العينات التي تم تحديدها بشكل غير صحيح من قبل الثقافة 13 سلبية كاذبة وعينة إيجابية كاذبة واحدة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول الأساسي مع العديد من Campylobacter spp. وسوف تسمح لعدد من البكتيريا Campylobacter التي تنتج أعراض التهاب المعدة والأمعاء في البشر ليتم تحديدها ومعدلات الانتشار ليتم تحديثها.

Introduction

نشرت مراكز الولايات المتحدة لمكافحة الأمراض (CDC) مؤخرًا أن برنامج المراقبة النشطة للأمراض المنقولة بالأغذية (FoodNet) أبلغ عن 9723 حالة من حالات العدوى الكامبيلوباكتر التي تم تشخيصها مختبريًا في عام 2018¹. ويمثل ذلك زيادة بنسبة 12% في تقارير قضية كامبيلوباكتر عن الفترة 2015-2017¹. في جميع أنحاء العالم، Campylobacter spp. هي من بين الالتهابات المعوية البكتيرية الأكثر شيوعا². ومع ذلك ، فإن أعداد الأمراض المعوية القائمة على Campylobacterالتي تحدث كل عام يشتبه في أن يتم الإبلاغ عنها بشكل غير صحيح³. هذا التقليل من شأنه يمكن التنبؤ به لأن معظم المرضى يمكن أن يتعافى مع عدم الراحة المعتدلة فقط وعدم وجود علاج طبي. ومع ذلك ، بالنسبة للمرضى الذين يعانون من أعراض أكثر حدة أو الذين هم أكثر عرضة للإصابة بأمراض خطيرة ، والذين يسعون بعد ذلك إلى الرعاية الطبية ، فإن ثقافة البراز هي الطريقة الأكثر شيوعًا لتقييم ما إذا كان Campylobacter هو العامل الممرض الذي يسبب ضيقهم^4.

لCampylobacter spp., ثقافة البراز هو مزعج بشكل خاص. الكائنات المسببة للأمراض الأكثر شيوعا، C. jejuni، C. القولونية، C. upsaliensis، وC. لاري، هي microaerophilic⁵. وهذا يعني أن البكتيريا سوف تموت عشوائيا، معدلات غير معروفة مرة واحدة تتعرض للهواء. الوقت بين جمع العينات وإعداد الثقافة وبالتالي يصبح متغير غير المنضبط في القدرة على الكشف عن قابلة للحياة Campylobacter spp. حسب الثقافة.

لثقافة مباشرة من عينات البراز، والنمو البطيء للكامبيلوباكتر هو أيضا مشكلة. مستعمرات Campylobacter صغيرة جدا حتى بعد 48 ساعة من الحضانة ويمكن تغطيتها بسهولة من قبل الكائنات الحية المتنافسة في مصفوفة البراز. وتستخدم على نطاق واسع لوحات التي تحتوي على المضادات الحيوية التي معظم سلالات من C. jejuni وC. القولونية هي مقاومة، كما تمنع المضادات الحيوية نمو العديد من (ولكن ليس كل) البكتيريا البرازالمتنافسة، مما يسمح تصور أفضل من مستعمرات كامبيلوباكتر ⁶. ومع ذلك ، فإن الأنواع الأخرى Campylobacter مثل C. lari و C. upsaliensis حساسة لبعض هذه المضادات الحيوية ، وإما تنمو بشكل سيئ أو لا تنمو على الإطلاق. وهذا يساهم في نقص الإبلاغ عن التهابات كامبيلوباكتر من هذه الأنواع الحساسة للمضادات الحيوية⁷.

هناك سبب ثالث لماذا ثقافة Campylobacter قد تكون غير دقيقة. البكتيريا، عندما شدد، قد تبقى قابلة للحياة ولكن يمكن أن تصبح “غير صالحة للزراعة”⁸. وهذا يعني بحكم تعريفه أن الثقافة لن تكتشف البكتيريا الموجودة في العينة. عدد المرات التي يحدث هذا غير معروف⁸.

وبالنظر إلى هذه القضايا المحتملة مع الثقافة، استخدمنا أساليب مرجعية مقارنة متعددة بحيث نتائج الثقافة الخاطئة لم تجعل اختبار واحد للمقارنة تظهر غير دقيقة⁹. تم اختيار أساليب الثقافة المستخدمة (على سبيل المثال ، لوحات Campylobacter– انتقائية ، وسيلة نقل ، أكياس توليد الغاز) لأنها تستخدم على نطاق واسع في المختبرات السريرية لثقافة عينة البراز¹⁰.

تم تطوير بروتوكولات الثقافة الموصوفة هنا لأن أقل عدد من كامبيلوباكتر جيجوني التي يمكن اكتشافها من قبل الثقافة في البراز البشري لم يكن معروفا. على الرغم من أن التقديرات قد نشرت لأعداد من وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) موجودة في براز الدواجن^11،لا يمكن أن تكون هذه النتائج مساوية البراز البشري، كما Campylobacter spp. هي commensals في الدجاج، ولا تسبب الإسهال. هذه المعلومات الأساسية مطلوبة لتحديد أعداد البكتيريا Campylobacter التي من شأنها أن تنتج أعراض التهاب المعدة والأمعاء في البشر ومقارنة الفوعة بين السلالات أو الأنواع.

Protocol

1. تعداد Campylobacter في عينات البراز البشري المفتعلة ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام تقنية معقمة والمواد على ورقة واقية يمكن التخلص منها داخل غطاء سلامة تدفق الصفيحة المطهر. تنبيه: الكامبيلوباكتر الحية معدية ويمكن أن تسبب المرض، بما في ذلك الإسهال. ارتداء القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة كلما التعامل مع البكتيريا. لا أنبوب الفم. التخلص من جميع المواد التي اتصلت البكتيريا في حاويات المخاطر البيولوجية المناسبة. نمو ثقافة المخزون من البكتيريا الحصول على سلالات من جيم jejuni (ATCC-33560) أو C. القولونية (ATCC 33559)(جدول المواد)والثقافات المجففة أو المجمدة وترطيب أو ذوبان البكتيريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الشرائط البكتيريا rehydrated على لوحة كاجار Campylobacterمحددة لبدء الثقافة. احتضان لوحة 48 ساعة في 37 درجة مئوية في جرة اللاهوائية التي تحتوي على الغلاف الجوي الجزئي توليد الغاز كيس. في اليوم التالي، إعداد 100 مل من ضخ الدماغ والقلب (BHI) مرق النمو التي تحتوي على 0.5٪ trypticase، 0.5٪ البروتياز بيبتوني، 0.0125٪ بيروفات الصوديوم، و 0.0125٪ بيسولفيت الصوديوم. قبل تقليل مرق BHI من خلال تغطية قارورة فضفاضة ووضعها في جرة اللاهوائية مع كيس من شأنها أن تنتج بيئة microaerophilic. السماح مرق ليقلل مسبقا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. وبالمثل، قبل تقليل Campylobacter-لوحاتمحددة لاستخدامها في تعداد مستعمرة في الخطوات 1.1.10 و 1.2.2. كما Campylobacter حساسة للهواء، وجمع جميع المواد قبل تلقيح مرق ولا تتسكع أثناء التعامل مع الثقافات. عندما تكون جاهزة للتلقيح، أضف مصل الأبقار الجنيني (FBS) إلى مرق مخفض مسبقًا إلى 4٪ من إجمالي الحجم. احتفظ بـ 1 مل من مرق مقلص مسبق ًا ليكون بمثابة فارغة في قياسات الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600). إزالة 3 مل من مرق قبل تخفيض تحتوي على FBS واستخدام مرق لكشط لوحة بداية تحتوي على ثقافة Campylobacter. كشط بلطف لوحة مع حلقة التلقيح، ومن ثم نقل الطين البكتيري إلى أنبوب معقم. Inoculate 100 مل من مرق خفضت مسبقا مع ما يقرب من 3 مل من الطين البكتيري واحتضان مع اهتزاز معتدل في 115 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية في جرة اللاهوائية التي تحتوي على كيس توليد الغاز. رصد نمو البكتيريا الطيفية عن طريق التعكر في OD600. استخدم المرق المحجوز كفارغ. إذا تم فتح الجرة اللاهوائية، استبدال كيس توليد الغاز. توقف عن حضانة المرق بعد 48-72 ساعة أو قبل أن تصل قيمة OD600 إلى ~ 0.4.ملاحظة: هذا OD600 يساوي عادة إلى 107 إلى 108 CFU/mL. راجع الجدول 1 للحصول على النتائج النموذجية. لتحديد عدد من البكتيريا في ثقافة المخزون النقي، أداء ثمانية 10 أضعاف سلسلة تخفيف 10 ميكرولتر من مرق في 900 ميكرولتر من تخفيف العازلة(جدول المواد). بعد 100 ميكرولتر من مرق قد أزيلت للتخفيف الأول، والعودة قارورة إلى جرة اللاهوائية مع كيس جديدة لتوليد الغاز في انتظار استخدامها في بركة البراز spiking. استخدام حبات الطلاء المعقمة لنشر 100 ميكرولتر من10-5 إلى10-7 تخفيف على مكررة preylobacterلوحات محددة من الخطوة 1.1.3. لوحات التسمية مع تخفيف المستخدمة، ووضعها في جرة اللاهوائية الثانية مع كيس توليد الغاز، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة.ملاحظة: انظر الشكل 1 والشكل 2 لنظام التخفيف وصور المستعمرات. بعد النمو، اختر الطبق الذي يتراوح بين 30-300 مستعمرة لعدها. الاستفادة من التهم لتحديد CFU / مل من ثقافة مرق الأسهم باستخدام المعادلة 1 :CFU/ mL في المخزون = متوسط # من المستعمرات على لوحات تحليلية مختارة (مكررة) ☆ (مل مطلي × تخفيف لوحة) [المعادلة 1] إعداد وتعداد عينات البراز السريرية المفتعلة مباشرة بعد إعداد لوحات للعد التحليلي في الخطوة 1.1.10، وجعل مجموعة ثانية من تخفيف مرق الأسهم من خلال إعداد 10 التمييع المسلسل 2 أضعاف من مرق الأسهم وبركة البراز كامبيلوباكتر-السلبية (NFP). على سبيل المثال، قم بإعداد التخفيف الأول عن طريق خلط كميات متساوية من مرق وNFP (على سبيل المثال، 0.1 مل لكل منهما) وجعل التخفيفات اللاحقة عن طريق نقل حجم معين من مرق وخليط NFP في أنبوب مع حجم معين يساوي NFP. إضافة لوحة التحكم مع مرق لا يحتوي على Campylobacter تضاف إلى تجمع البراز للمساعدة في تحديد المستعمرات غيرCampylobacter. جعل NFP من غير محددة, عينات مراقبة المريض الإسهال أو البراز المتبرعين صحية التي تم اختبارها سابقا وجدت أن Campylobacter-السلبيةبطرق مثل المناعة إنزيم كامبيلوباكتر و16S rRNA qPCR. T-streak 10 μL من كل Campylobacter/ تخفيف البراز على مكررة preylobacter-لوحات أغار محددة. وضع لوحات في جرة اللاهوائية مع كيس توليد الغاز واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48 ± 2 ساعة. فحص لوحات streaked بصريا للمستعمرات تشبه تلك التي من ثقافات كامبيلوباكتر نقية.ملاحظة: الربع الثالث هو عادةً حيث سيتم العثور على هذه. انظر الشكل 1 والشكل 2 لنظام التخفيف والصور من حجم المستعمرة واللون والشكل. حدد Multi Campylobacterمثل المستعمرات ووصمة عار غرام. باستخدام المجهر مع عدسة الغمر النفط، ودراسة منطقة رقيقة الشرائط للبكتيريا الصغيرة المنحنية سلبية الغرام، حلزونية، أو على شكل سيجار.ملاحظة: Campylobacter هي سلبية الغرام وتتطلب فوشين الأساسية كمضادة (بدلا من safranin نموذجية) ليتم تصورها بدقة. ويمكن رؤية البكتيريا الكلاسيكية ذات المجنحة النورس ولكن ها هي ليست شرطا. انظر الشكل 2 للميكروجراف التمثيلي. إذا كان أي من لوحات مكررة في تخفيف محددة لديها 1 أو أكثر من مستعمرات Campylobacter الحالية، والنظر في أن تخفيف البراز الثقافة إيجابية. النظر في التخفيف الأخير الذي يحتوي على Campylobacterمرئية – مثل مستعمرة سلبية الغرام الحد من الكشف عن الثقافة. استخدم المعادلة 2 لحساب CFU/mL للتخفيف الإيجابي في عينة البراز السريرية المفتعلة:CFU/mL في عينة البراز = تحليلي CFU/mL ☆ تخفيف مع مستعمرة إيجابية الماضي [المعادلة 2]ملاحظة: راجع الجدول 2 للحصول على نتائج نموذجية. 2. تحديد قابلية البقاء من Campylobacter المخزنة في وسائل الإعلام النقل مزيج 1 مل من ثقافة مرق Campylobacter (الخطوة 1.1.8) مع 1 مل من NFP وإعداد 10 مكررة ضعف المسلسل مرتين في NFP. مزيد من تخفيف كل تخفيف إضافية 1:4 في وسائل الإعلام كاري بلير، تماما كما يتم التعامل مع عينة سريرية أعدت في وسائل الإعلام النقل. قم بتخزين أنابيب التخفيف العشرين وعنصر تحكم سلبي في وسط كاري بلير في أنابيب مغطاة عند 2-8 درجة مئوية لـ 96 ساعة وعد مستعمرات من كل تخفيف يحدث في الوقت صفر وكل 24 ساعة. لعد مستعمرة، عينة المرق: أنابيب البراز وثقافة البراز الإعداد لمستعمرة العد من كل تخفيف، في مكررة. كل يوم لوحة 10 ميكرولتر أجزاء من تخفيف البراز على Campylobacter-agar انتقائية واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، كما هو موضح أعلاه في الخطوات 1.1.9−1.2.7. إجراء عدد تحليلي متزامن للمخزون البكتيري الأصلي (من الخطوة 1.1.8 أو مرق طازج) كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1.1.9−1.1.11). حساب CFU / مل من المخزون البكتيري الأصلي(المعادلة 1)لحساب تركيز البكتيريا في عينة البراز وسائل الإعلام النقل والتخفيفات لها(المعادلة 2). 3. مقالات غير ثقافية للتحقق من نتائج الثقافة استخدام الانزيم المناعي (EIA) الذي يعطي نتائج إيجابية كاذبة ضئيلة12 وأداء وفقا لتعليمات إدراج حزمة للتحقق من نتائج الثقافة. استخدام الفحص الجزيئي التي يمكن الكشف عن الجينات rRNA 16S أو غيرها من الجينات من مجموعة واسعة من الأنواع كامبيلوباكتر 13. تأكد من أن القياس الجزيئي يتفاعل مع أنواع مثل C. upsaliensis أو C. lari التي تنمو بشكل سيئ على agar14القياسية التي تحتوي على المضادات الحيوية. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لاستخراج الحمض النووي من عينات البراز وإجراء الاختبار.ملاحظة: يمكن استخدام تسلسل الحمض النووي ثنائي الاتجاه من amplicon 16S لتأكيد نوع Campylobacter في عينة إيجابية. ويمكن أيضا استخدام PCR الأنواع محددة (انظر الجدول 3 للجينات المستهدفة) لتحديد الأنواع الموجودة في العينات الإيجابية أو discrepant15 .

Representative Results

تحديد Campylobacter spp. المستعمرات بين النباتات البراز المتنافسة يتطلب البصر حريصة وحكم كبير. لم تتم دراسة أقل عدد من المستعمرات التي يمكن اكتشافها بواسطة الثقافة ، على الرغم من أن العينات من المرضى قد قدرت لإيواء 106-109 CFU / mL16،17. ومع ذلك، لا يمكن استخدام عينات المرضى كمياً حيث لا توجد طريقة مستقلة لتحديد أرقام بكتيرية دقيقة. للتغلب على هذا القيد، يتم إجراء قياسين متزامنين مع مخزون بكتيري واحد. ويستخدم اختبار واحد للكشف البصري للمستعمرات Campylobacter من تخفيف المسلسل من البكتيريا المخزون في مصفوفة البراز، ومحاكاة العينات السريرية؛ ويستخدم الآخر تحليليا لتحديد حجم CFU / مل موجودة في ثقافة المخزون البكتيري المستخدمة لspiking(الشكل 2A). لن يتم تعريف عتبات الكشف لCampylobacter القيم. هذا هو المتوقع لأن كل مصفوفة البراز معقدة وفريدة من نوعها، ونمو البكتيريا هو متغير. المعلمة الرئيسية للنجاح هو تحديد المستعمرات حجم محدد بين النباتات البراز المتنافسة. يظهر لوحة تمثيلية لثقافة البراز المُرتفعت في الشكل 2C والشكل 2D. لوحة التحكم السلبية دون إضافة Campylobacter مهم للمساعدة في تحديد النباتات البرازية الأخرى. غرام تلطيخ العديد من المرشحين أيضا تدريب العين للتمييز بين المستعمرات لامعة الصحيح واللون الوردي المتوسط من الفوشين الملطخة الغرام السلبي البكتيريا ويؤكد مورفولوجيا البكتيريا في المستعمرات المختارة(الشكل 2B). أجريت سبع تجارب مستقلة، باستخدام 5 C. jejuni و 2 C. القولونية مرق، وأعطى العتبات التي تداخلت وامتدت من 0.3-5 × 106 CFU/mL. راجع الجدول 2 للحصول على بيانات نموذجية. وبلغ متوسط حدود الكشف 2 × 106 لجيم جيجوني و 1.2 × 106 CFU / mL لC. coli. وهذا يشير إلى أن الثقافة يمكن أن تكشف على الأرجح ~ 1-2 × 106C. jejuni أو C. coli لكل غرام من عينة البراز على الكابيلاكتر الكابيلاكتالقياسي الذي يحتوي على المضادات الحيوية المستخدمة من قبل العديد من المختبرات السريرية. هناك العديد من الأجار المتخصصة مع المضادات الحيوية المختلفة التي قد تعطي عتبات مختلفة للكشف عن مستعمرة. وينبغي للأساليب الموصوفة هنا أن تشجع على إجراء المزيد من الدراسات الكمية والمقارنة لتحسين دقة الثقافة وتوسيع نطاق تعدد وسائط الإعلام الجديدة. على سبيل المثال، تم حساب 152 مستعمرة على أول10-5 لوحة و 144 مستعمرات على لوحة10-5 الثانية. المعدل بين الاثنان لوحات 148 مستعمرات. تم تلقيح اللوحات مع 0.1 مل (100 ميكرولتر) من10-5 تخفيف، والتي من قبل المعادلة 1 يعادل 148 × 106 (14.8 × 107)CFU/mL في مخزون الثقافة النقية. عندما تم إجراء تخفيف البراز ، تم ارتفاع الثقافة إلى بركة البراز السلبية بنسبة 1:1. لذلك ، من خلال المعادلة 2، تتوافق النقطة الأولى (اللوحة “a”) على منحنى البراز مع 14.8 × 107 مقسومًا على 2 وتساوي 7.4 × 107 CFU / mL. يستخدم هذا الأنبوب “أ” لجعل 9 تخفيفات إضافية. في الشكل 1، التخفيف الأخير مع مستعمرة واحدة واضحة سالبة الغرام مع Campylobacter- مثل مورفولوجيا على لوحة “ز”. وهذا يعادل 1.1 × 106 CFU /mL لعتبة ثقافة البراز للكشف في هذا المثال. على الرغم من أن استمرارية الزرع هو مفتاح دقة الثقافة، فإن الاحتفاظ بصلاحية Campylobacter spp. أثناء التعامل مع العينات وشحنها من المرضى إلى العيادات إلى المختبرات المرجعية هو أمر إشكالي. التخزين النموذجي هو تبريد العينات في أنابيب عادية مغطاة مع التعرض للهواء وبدون جو خاص. ويعتقد أن العينات في وسائل النقل (المعروفة أيضا باسم العينات المحفوظة) لديها بقاء أفضل، ولكن هناك تقارير قليلة توفر بيانات كمية18. واستخدم مرة أخرى الجمع بين أساليب العينات التحليلية والأساليب المفتعلة المبينة أعلاه للحصول على تقديرات مدى صلاحية ووقت البقاء لجيم جيجوني في وسائط النقل. تم استخدام مرق مخزون بكتيري لإعداد عشرة مكررة 2 أضعاف إلى 1024 أضعاف تخفيف العينة في مصفوفة البراز. تم العثور على مرق الأولي من قبل العد التحليلي أن يكون التركيز من 4.8 × 107 CFU /mL. على لوحات المحرز في اليوم 0، تم الكشف عن C. jejuni (2 بعد أيام) على لوحة ملطخة مع تخفيف 32 أضعاف، أي ما يعادل 1.5 × 106 CFU/mL. ومع ذلك ، على لوحات مصنوعة بعد تبريد عينة البراز كاري بلير لمدة 24 ساعة ، فقط تخفيف 2 أضعاف (ما يعادل 2.4 × 107 CFU / مل) نمت المستعمرات المرئية. ولم يُشاهد أي فقدان آخر للاستمرار ية إلى 96 ساعة، عندما توقفت الدراسة. ويعادل هذا الفقدان في القدرة على البقاء 16 ضعفاً (94%) فقدان الكائنات القابلة للزراعة في أقل من 24 ساعة ، ويشير إلى أنه ، حتى مع التبريد ، قد يفتقد البراز في Cary Blair المتوسط مع أقل من 107 CFU / mL C. jejuni من قبل الثقافة. وعلى النقيض من نتائج الثقافة، اكتشف تقييم الأثر البيئي وجود جيم جيجوني عند التخفيف البالغ 256 ضعفاً عند النقطة الزمنية الأولية وطوال فترة الاختبار البالغة 4 أيام. وعتبة الكشف عن C. jejuni لهذا تقييم الأثر البيئي باستخدام عينات البراز ارتفعت هو 8.4 × 104 CFU /mL. هذه العتبة هي أقل من تلك التي من ثقافة البراز ويسمح الكشف أكثر حساسية واستقرارا من C. jejuni. لاختبار قدرة الثقافة على الكشف عن Campylobacter spp. في وضع سريري فعلي ، تميزت 1552 عينة براز سريرية بـ 6 إجراءات: ثقافة البراز ، واستئصال المناعة الجديد لCampylobacter spp.، و 4 طرق جزيئية. تم جمع جميع العينات في المستقبل وتصنيفها في البداية حسب الثقافة التقليدية في 3 مختبرات في الولايات المتحدة، ثم تم فحصها عبر هاوية تقييم الأثر البيئي. ثم تم فحص أي عينات إيجابية للثقافة أو EIA /culture-discrepant بواسطة الطرق الجزيئية12. تم تعيين العينات حالة إيجابية حقيقية أو سلبية حقيقية استناداً إلى نتائج الأساليب غير الثقافية الخمسة. وأظهرت الأساليب الخمس غير الثقافية اتفاقاً كاملاً على جميع العينات الإيجابية والمنسبة البالغ عددها 48 عينة، في حين أساءت الثقافة تحديد 14 عينة (28 في المائة). وشملت العينات التي تم تحديدها بشكل غير صحيح من قبل الثقافة 13 سلبية كاذبة وعينة إيجابية كاذبة واحدة. الشكل 1: مخطط للإعداد المتزامن لعينات البراز التحليلية والمسامير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: تحديد مستعمرات ج. جيجوني من الثقافات النقية والبرازية. (أ)صورة لمستعمرات سي جيجوني من الثقافة البكتيرية النقية بعد 72 ساعة من الحضانة. (ب)غرام وصمة عار من C. jejuni من الثقافة البكتيرية النقية، النفط الغمر 400x التكبير. (C)صورة لجيم jejuni-positive ارتفعت ثقافة البراز بعد 48 ح الحضانة. (D)منطقة مكبرة في مربع في(C)،10x التكبير. الأسهم البيضاء تشير إلى دبوس نقطة حجم الغرام سالب المستعمرات جيجوني. يشير رأس السهم الأسود إلى مستعمرة أكبر قليلاً ، إيجابية الجرام ، وليس C. jejuni. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الثقافات OD600 @ T0 OD600 @ T النهائي1 CFU النهائي / مل ج. جيجوني 0.146 0.321 1.28 × 107 جيم كولاي 0.245 0.508 4.50 × 108 الجدول 1: النمو النموذجي وCFU/mL من أسهم C. jejuni و C. coli. 1جيم توقفت ثقافةجيجوني بعد 48 ساعة من الحضانة. C. تم إيقاف ثقافة القولونية بعد 54 ساعة من الحضانة. أنبوب تخفيف لعينة البراز ارتفعت عدد المستعمرات الكامبيلوباكتر عدد المستعمرات سالبة الغرام1 الثقافة إيجابية؟ CFU/mL المحسوبة من عينة ارتفعت جيم جيجوني (1.28 × 108 مخزون CFU/mL) (2 أضعاف) أ كثيفه الثانيالثاني نعم 6.40 × 107 (4 أضعاف) ب 20+ Nd نعم 3.20 × 107 (8 أضعاف) ج 4-10 Nd نعم 1.60 × 107 (16 أضعاف) د Nd نعم 8.00 × 106 (32 أضعاف) ه Nd نعم 4.00 × 106 (64 أضعاف) و 1-3 1 من 2 نعم 2.00 × 106 (128 أضعاف) ز 2 من 3 نعم 1.00 × 106 3(256 أضعاف) ح 1 من 2 نعم 5.00 × 105 (512 أضعاف) ط 0 من 1 لا 2.50 × 105 (1024 أضعاف) ي 0 Nd لا NFP C. القولونية (4.50 × 108 CFU / mL المخزون) (2 أضعاف) أ كثيفه Nd نعم 2.25 × 108 (4 أضعاف) ب Nd نعم 1.13 × 108 (8 أضعاف) ج 50+ Nd نعم 5.63 × 107 (16 أضعاف) د 30+ Nd نعم 2.81 × 107 (32 أضعاف) ه 10+ Nd نعم 1.41 × 107 (64 أضعاف) و 3-8 Nd نعم 7.03 × 106 (128 أضعاف) ز Nd نعم 3.52 × 106 3(256 أضعاف) ح 1-3 1 من 3 نعم 1.76 × 106 (512 أضعاف) ط 0 من 1 لا 8.79 × 105 (1024 أضعاف) ي 0 Nd لا NFP الجدول 2: الأعداد النموذجية للمستعمرات على لوحات عينات البراز المعزّزة. 1 المستعمرات السلبية غرام بين مستعمرات مثل Campylobacter، 2nd = لم يتم تحديدها، 3البيانات في نوع غامق يشير إلى تخفيف إيجابي الماضي. الانواع هدف الجينات ج. جيجوني هيبو جيم كولاي cadF جيم – upsaliensis cpn60 جيم لاري cpn60 جيم- هيلفيتيموس cpn60 جيم – الجنين cpn60 جيم – الهيوويالا cpn60 جيم – الكونكيموس cpn60 الجدول 3: الجينات المفيدة للكشف عن الأنواع الفردية Campylobacter qPCR.

Discussion

يتم بناء أساليب الثقافة الموصوفة هنا على تقنيات ومواد بسيطة ومستخدمة على نطاق واسع متوفرة في معظم المختبرات^10. إن الجمع بين العينات التحليلية والعينات المفتعلة هو الذي يوفر معلومات جديدة عن عتبة الكشف ذات الصلة سريرياً لثقافات البراز. بالإضافة إلى ذلك، الفصل في نتائج الثقافة مع 5 مقالات منفصلة يعزز الاستنتاجات التي Campylobacter ثقافة البراز mis-يحدد جزء كبير من عينات المريض. واختبارات تقييم الأثر البيئي والمواد الجزيئية مفيدة كضوابط لأن كل منها يستند إلى مبدأ مختلف (تفاعل المستضد مع الأجسام المضادة مقابل تضخيم الحمض النووي) والأهم من ذلك، لا تعتمد على صلاحية البكتيريا. لاحظ أن فحص تقييم الأثر البيئي المستخدم في هذه الدراسات تم التحقق منه بشكل جيد وقد ثبت أنه يتفق تمامًا مع 4 اختبارات جزيئية¹².

إن ثقافة Campylobacter spp. مزعجة بشكل خاص، حيث تفيد التقارير بأن الحساسية تتراوح بين 60-76٪^19،20، وكما هو واضح من معدل الفشل في اكتشاف العينات الإيجابية الحقيقية هنا بنسبة 30٪. يمكن للموظفين أن يتوقعوا أن التحكم في تقييم الأثر البيئي والاختبارات الجزيئية ستسفر في كثير من الأحيان عن نتائج إيجابية عندما تكون بيانات الثقافة سلبية.

الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تحديد مستعمرات دبوس نقطة بين النباتات البراز المتنافسة. وليس من غير المألوف، كتخفيفات بالقرب من عتبة الكشف، أن يكون هناك تقديرات بالتناوب لعدد المستعمرات صفر امن وغير صفر (على سبيل المثال، 2، 0، 1، 0، 0). ومن المهم الاعتراف بأن عتبات الثقافة ستكون مجموعة من التركيزات، وليس تركيزاً محدداً من نوع CFU/mL. ومع ذلك ، فإن تقدير ~ 1 × 10⁶ CFU / mL البراز كحد أدنى للكشف عن الثقافة يقارن بشكل جيد مع التقارير التي البشر المصابين تسليط 10⁶ إلى 10⁹Campylobacter لكل البراز غرام²¹. التغيرات في المضادات الحيوية أو لوحات أجار والاختلافات التي لا مفر منها في عينات البراز الفردية سوف تغير بلا شك قيم العتبة. يجب أن يمكّن هذا البروتوكول من إدخال تحسينات على وسائط النمو.

هذه المعلومات الأولى عن الحد من الكشف عن الثقافة يجعل من الممكن لوضع عتبات ذات الصلة سريريا لاختبارات التشخيص، ويضع الأساس الميكروبيولوجي الذي هو مطلوب لمعالجة القضايا غير المدروسة من غير أعراض النقل^22،23 من قبل Campylobacter،أو إذا كان الحمل البكتيري يرتبط مع الأعراض أو عواقب خطيرة.

Materials

Anaerobic 3.5L Jar	Thermo Fisher	HP0031A
AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar	Hardy Diagnostics	AG701
Bacto Brain Heart Infusion	BD Biosciences	237500
Bacto Protease Peptone	Life Technologies Corp	211684
Basic Fuchsin	Fisher Scientific	B12544
BBL Trypticase Peptone	Life Technologies Corp	211921
C. coli Type strain	ATCC	33559
C. jejuni Type strain	ATCC	33560
CampyGen gas generating system sachet	Thermo Fisher	CN0025A
Campylobacter QUIK CHEK	TechLab, Inc.	T5047 / T31025
Cary-Blair transport medium	Fisher Scientific	23-005-47
Coli Roller Sterile plating beads	Millipore Sigma	71013
Dilution Buffer	Anaerobe Systems	AS-908
Fetal bovine serum	Equitech-Bio, Inc	SFBM30
Sodium bisulfite	Sigma-Aldrich	243973
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Spectrophotometer cuvettes	USA Scientific	9090-0460