תרבות של וריאציה של המושבה הקטנה של הפסאודומונס וככמת של האלגיאט
Summary
כאן, אנו מתארים מצב גדילה לתרבות המשתנה המושבה הקטנה של הפסאודומונס aeruginosa. כמו כן, אנו מתארים שתי שיטות נפרדות לאיתור וכימות של הייצור המיוצר על ידי P. aeruginosa באמצעות חומצה אוראלה מסורתי בזולה ומעין נוגדן חד-שבטיים ספציפי קילוף פלסטיצידיות (mab) מבוסס אליסה.
Abstract
פסאודומונס aeruginosa, פתוגן שלילי גרם-שלילית, יכול לייצר יתר על כך התוצאה היא פנוטיפ ייחודי הנקרא מוסטיידי. Alginate מקושר זיהומים ריאה כרונית וכתוצאה מכך פרוגנוזה גרועה אצל חולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF). הבנת מסלולים כי לווסת את הייצור של קילוף פלסטיצידיות יכול לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות הרומן מיקוד היווצרות קילוף פלסטיצידיות. עוד פנוטיפ הקשורות למחלות הוא משתנה המושבה הקטנה (SCV). SCV הוא בשל הצמיחה האיטית של חיידקים, הקשורים לעתים קרובות עם עמידות מוגברת antimicrobials. במאמר זה, אנו הראשון להראות שיטה של culturing טופס מוגדר גנטית של P. aeruginosa scv בשל המוטציות הביוסינתזה של פיקנוmidine. תוספי בסיסים ניטרוני, אורציל או ציטוסין, מחזירה את הצמיחה הנורמלית למוטציות אלה, הפגנת נוכחות של מסלול הצלה הscavenges בסיסים חינם מהסביבה. לאחר מכן, אנו דנים בשתי שיטות למדידת האלגיאט חיידקי. השיטה הראשונה מסתמכת על ההידרוליזה של הפוליסכד לתוך החומצה האוריונית שלה ולאחריו בעקבות השפעת מגיב כרומוגניים, קרזולה, בעוד השיטה השנייה משתמשת ב-אליסה בהתבסס על מסחרית זמין, alginate ספציפי ספציפיים. שתי השיטות דורשות עקומה סטנדרטית לכימות. כמו כן, אנו מראים כי השיטה החיסונית היא ספציפית לכמת וניתן להשתמש בה למדידת האלגיאט בדגימות הקליניות.
Introduction
דלקות ריאות כרוניות עם הפסאודומונס aeruginosa הם הגורם העיקרי של תחלואה ותמותה אצל חולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF). במהלך הילדות המוקדמת, חולים הם הכובש על ידי פתוגנים חיידקיים מרובים כולל מבודד nonmucoid של P. aeruginosa1,2. הופעתה של משתנה מושבה קטנה (SCV) מבודד, כמו גם mucoid מבודד הוא סמן עבור התחלתה של זיהומים כרוניים. מבודד SCV הם עמידים בפני סמים3 בשל שיעורי צמיחה איטית שלהם4, אשר מספקת להם הרתעה חמורה בחטיבות הטיפול וזיהומים כרוניים אחרים5 על ידי P. aeruginosa. העבודה על ידי Al אחמר ואח ‘6 הראה קשר בין scv ו-mucoidy מקושר על ידי הביוסינתזה דה נובו pyriine. פירימידין הרעב, בשל מוטציות בגנים המעורבים בייצור פירימידין, הביא את scv פניטיפ ב ההפניה nonmucoid התייחסות PAO1 ואת הנגזרת mucoid, PAO581 (PAO1mucA25).
אף-על-פי ייצור יתר של קילוף פלסטיצידיות הוא סמן מחלה חשובה עבור זיהומים ריאה כרונית ב-CF, לא ברור אם יש קורלציה ישירה בין כמות קילוף פלסטיצידיות פתולוגיה ריאות, וזה לא ברור אם קילוף פלסטיצידיות ניתן להשתמש כסמן פרוגנוזה לטיפול7. הייצור alginate מוסדר בעיקר על ידי שני operons, מעבד רגולציה (algumucabcd)8,9 ו הביו סינתטי המבצע (algd operons)10,11. הייצור alginate מוסדר בחוזקה על ידי פקטור סיגמא algu9,12 (הידוע גם בשם algt) והשפלה של הגורם האנטי סיגמא מוקה13. היכולת לפקח על ייצור קילוף פלסטיצידיות באתרו של המטופלים ‘ הרוק דגימות יכול לסייע בפיתוח של אפשרויות טיפוליות הרומן.
כאן, אנו מתארים מצב גדילה המזהה את נוכחותו של scv הנגרמת על ידי מוטציות שאינן יכולות לסנתז את פירימידין דה נובו. תוספת של אורציל ו/או ציטוסינוס, בסיס ניטרוגליצרין של פירימידין נוקלאוטיד, למדיום מפעיל את מסלול ההצלה, ובכך לשקם את הצמיחה הנורמלית של המוטציות. זו שיטת הצמיחה עבור אלה מוטציות scv ספציפיות ניתן להשתמש כשיטת הקרנה כדי לזהות מוטציות פירימידין בדגימות החולה. בנוסף, אנו דנים בשתי שיטות לאיתור ומדידה של קילוף פלסטיצידיות המיוצר ומופרש על ידי P. aeruginosa. הראשונה היא השיטה המסורתית14,15,16 משפילה את הפוליסכד באמצעות ריכוז גבוה של חומצה ולאחר מכן הוספת מחוון הצביעה כדי לכמת את הריכוז במדגם. השיטה השנייה, שפותחה במעבדה שלנו, מנצלת את היישום החיסוני הקשור לאנזימים (אליסה) באמצעות נוגדן חד-שבטיים אנטי-אלגיאט (mAb) שפותח על ידי QED ביולוגיה. השיטה אליסה מוכיחה להיות ספציפי יותר ורגיש יותר מאשר שיטת חומצה אוראונית ומאפשר שימוש בטוח יותר בשל הימנעות של חומצה גופרתית מרוכזת מאוד. עם היכולת של ה-אליסה לשמש ישירות על דגימות החולה רוק למדוד קילוף פלסטיצידיות, זה יכול להיות מפותח ככלי אבחון ניטור לעקוב אחר כמות קילוף פלסטיצידיות נוכח הריאות בתקופות שונות של הזיהום.
Protocol
Representative Results
Discussion
שניהם scv ו קילוף פלסטיצידיות הם סמנים חשובים מחלות מעורבים זיהומים כרוניים מספר. לכן, את היכולת לגדל scv, כמו גם ללמוד את התקנה וייצור של קילוף פלסטיצידיות על ידי P. aeruginosa הוא אינטגרלי לגילוי של טיפולים חדשניים למחלות כרוניות אלה.
זנים SCV הם לשמצה קשה לגדול עקב שיעור הצמיחה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים R44GM113545 ו P20GM103434.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
