Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats
Summary
Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, um die kleine Kolonievariante von Pseudomonas aeruginosazu kulturen. Wir beschreiben auch zwei separate Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung des von P. aeruginosa hergestellten Exopolysaccharidalginats mit einem traditionellen Uronsäure-Carbazol-Assay und einem alginatspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) basierenden ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, ein opportunistischer gramnegativer bakterieller Erreger, kann ein Exopolysaccharidalginat überproduzieren, was zu einem einzigartigen Phänotyp namens Schleimhaut führt. Alginat ist mit chronischen Lungeninfektionen verbunden, was zu einer schlechten Prognose bei Patienten mit Mukoviszidose (CF) führt. Das Verständnis der Wege, die die Produktion von Alginat regulieren, kann bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien helfen, die auf die Alginatbildung abzielen. Ein weiterer krankheitsbedingter Phänotyp ist die kleine Kolonievariante (SCV). SCV ist auf das langsame Wachstum von Bakterien zurückzuführen und oft mit einer erhöhten Resistenz gegen antimikrobielle Mittel verbunden. In diesem Beitrag zeigen wir zunächst eine Methode zur Kultivierung einer genetisch definierten Form von P. aeruginosa SCV aufgrund von Pyrimidin-Biosynthesemutationen. Ergänzung der stickstoffhaltigen Basen, Uracil oder Cytosin, gibt das normale Wachstum zu diesen Mutanten, zeigt das Vorhandensein eines Bergungsweges, der freie Basen aus der Umwelt auffängt. Als nächstes diskutieren wir zwei Methoden zur Messung von bakteriellem Alginat. Das erste Verfahren beruht auf der Hydrolyse des Polysaccharids auf sein Uronsäuremonomer, gefolgt von der Derivatisierung mit einem chromogenen Reagenz, Carbazol, während das zweite Verfahren einen ELISA verwendet, der auf einem kommerziell erhältlichen, alginatspezifischen mAb basiert. Beide Methoden erfordern eine Standardkurve für die Quantifizierung. Wir zeigen auch, dass die immunologische Methode spezifisch für die Alginatquantifizierung ist und für die Messung von Alginat in den klinischen Proben verwendet werden kann.
Introduction
Chronische Lungeninfektionen mit Pseudomonas aeruginosa sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit Mukoviszidose (CF). In der frühen Kindheit werden die Patienten von mehreren bakteriellen Krankheitserregern besiedelt, einschließlich nichtmucoiden Isolaten von P. aeruginosa1,2. Die Entstehung der kleinen Kolonievariante (SCV) Isolate sowie Schleimhautisolate ist ein Marker für den Beginn chronischer Infektionen. SCV-Isolate sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsratenhochresistent3 , was sie zu einer schweren Abschreckung in den Behandlungsregimentern und anderen chronischen Infektionen5 von P. aeruginosamacht. Arbeiten von Al Ahmar et al.6 zeigten einen Zusammenhang zwischen SCV und Schleimhaut, der durch de novo pyrimidin Biosynthese verbunden ist. Pyrimidin-Hunger aufgrund von Mutationen in Genen, die an der Pyrimidinproduktion beteiligt waren, führte zu Einem SCV-Phänotyp im Nichtmucoid-Referenzstamm PAO1 und dem Schleimhautderivat PAO581 (PAO1mucA25).
Obwohl Alginat-Überproduktion ein wichtiger Krankheitsmarker für chronische Lungeninfektionen bei CF ist, ist es nicht klar, ob es einen direkten Zusammenhang zwischen der Menge an Alginat und Lungenpathologie gibt, und es ist unklar, ob Alginat als Prognosemarker fürdieBehandlung 7 verwendet werden kann. Die Alginatproduktion wird hauptsächlich durch zwei Operonen reguliert, einen regulatorischen Operon (algUmucABCD)8,9 und den biosynthetischen Operon (algD operon)10,11. Die Alginatproduktion wird durch den Sigma-Faktor AlgU9,12 (auch bekannt als AlgT) und den Abbau des Anti-Sigma-Faktors MucA13streng reguliert. Die Fähigkeit, die Produktion von Alginat vor Ort aus den Sputumproben der Patienten zu überwachen, kann bei der Entwicklung neuer therapeutischer Optionen helfen.
Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, der das Vorhandensein von SCV erkennt, das durch Mutanten verursacht wird, die pyrimidin de novo nicht synthetisieren können. Die Ergänzung von Uracil und/oder Cytosin, der stickstoffhaltigen Basis von Pyrimidinnukleotid, zum Medium aktiviert den Bergungsweg und stellt so das normale Wachstum von Mutanten wieder her. Diese Wachstumsmethode für diese spezifischen SCV-Mutationen kann als Screening-Methode zur Identifizierung von Pyrimidin-Mutationen in Patientenproben verwendet werden. Darüber hinaus diskutieren wir zwei Methoden zum Nachweis und zur Messung von Alginat, das von P. aeruginosahergestellt und abgesondert wurde. Die erste ist die traditionelle Methode14,15,16 der Abbau des Polysaccharids mit einer hohen Konzentration von Säure und dann Hinzufügen eines kolorimetrischen Indikators, um die Konzentration in der Probe zu quantitieren. Die zweite Methode, die in unserem Labor entwickelt wurde, nutzt den Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) mit einem von QED Biosciences entwickelten monoklonalen Antialginat-Antikörper (mAb). Die ELISA-Methode erweist sich als spezifischer und empfindlicher als der Uronsäure-Assay und ermöglicht eine sicherere Anwendung durch die Vermeidung der hochkonzentrierten Schwefelsäure. Mit der Fähigkeit des ELISA, direkt auf Patientensputumproben verwendet zu werden, um Alginat zu messen, kann es als Überwachungs-Diagnose-Tool entwickelt werden, um die Menge an Alginat in der Lunge in verschiedenen Perioden der Infektion zu verfolgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sowohl SCV als auch Alginat sind wichtige Krankheitsmarker, die an mehreren chronischen Infektionen beteiligt sind. Daher ist die Fähigkeit, SCV zu züchten sowie die Regulation und Produktion von Alginat durch P. aeruginosa zu untersuchen, ein wesentlicher Bestandteil der Entdeckung neuartiger Behandlungen für diese chronischen Krankheiten.
SCV-Stämme sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsrate4 im Vergleich zu anderen P. aeruginosa-Stämmen, die i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den Nationalen Instituten für Gesundheit (NIH) Stipendien R44GM1113545 und P20GM103434 unterstützt.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
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