L’obiettivo di questo studio era quello di stabilire un metodo per studiare le dinamiche cardiache utilizzando un modello animale traslazionale. L’approccio sperimentale descritto incorpora l’optocardiografia a doppia emissione in combinazione con uno studio elettrofisiologico per valutare l’attività elettrica in un modello cardiaco porcina isolato e intatto.
I modelli animali di piccole dimensioni sono più comunemente utilizzati nella ricerca cardiovascolare a causa della disponibilità di specie geneticamente modificate e dei costi inferiori rispetto agli animali più grandi. Eppure, i mammiferi più grandi sono più adatti per domande di ricerca traslazionale relative alla fisiologia cardiaca normale, alla fisiofisiologia e ai test preclinici degli agenti terapeutici. Per superare le barriere tecniche associate all’impiego di un modello animale più grande nella ricerca cardiaca, descriviamo un approccio per misurare i parametri fisiologici in un cuore di maialino isolato e perfuso da Langendorff. Questo approccio combina due potenti strumenti sperimentali per valutare lo stato del cuore: studio di elettrofisiologia (EP) e mappatura ottica simultanea di tensione transmembrana e calcio intracellulare utilizzando coloranti sensibili ai parametri (RH237, Rhod2-AM). Le metodologie descritte sono adatte per studi traslazionali che studiano il sistema di conduzione cardiaca, alterazioni nella morfologia potenziale d’azione, gestione del calcio, accoppiamento di contrazione eccitazione e l’incidenza di alternanze cardiache o Aritmia.
Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di malattia e morte in tutto il mondo. Come tale, un obiettivo di ricerca primaria è quello di ottimizzare le metodologie che possono essere utilizzate per studiare la fisiologia cardiaca normale e meccanismi sottostanti che possono contribuire alla morbilità e mortalità negli esseri umani. La ricerca cardiovascolare di base si è tradizionalmente affidata a piccoli modelli animali, tra cui roditori e conigli1,2,3, a causa della disponibilità di specie geneticamente modificate4,5, minore costo, ingombro sperimentale più piccolo e una maggiore produttività. Tuttavia, l’uso di un modello di suina ha il potenziale per fornire dati più rilevanti dal livello clinico6. Infatti, studi precedenti hanno documentato somiglianze nell’elettrofisiologia cardiaca (EP) tra esseri umani e suini, tra cui correnti ioniche simili7, forma potenziale di azione8e risposte ai test farmacologici9. Inoltre, il cuore porcina ha cinedi contrattili e relax che sono più paragonabili agli esseri umani di roditori o conigli10. Rispetto a un modello canino, l’anatomia coronaria porcina assomiglia più da vicino a un cuore umano11,12 ed è il modello di scelta per studi incentrati sullo sviluppo del cuore, cardiologia pediatrica e/o difetti cardiaci congeniti 13.Anche se ci sono differenze tra il maiale e il cuore umano8, queste somiglianze rendono il cuore di porcina un modello prezioso per la ricerca cardiovascolare14.
La perfusione retrograda del cuore è diventata un protocollo standard per lo studio delle dinamiche cardiache ex vivo15 dalla prima fondazione da Oskar Langendorff16. Di conseguenza, Langendorff-perfusione può essere utilizzato per sostenere un cuore isolato e intatto in assenza di influenze autonome. Questo modello è uno strumento utile per confrontare direttamente l’elettrofisiologia cardiaca e la contrattilità tra cuori sani e non sani. Poiché le dinamiche cardiache sono complesse sia dal tempo che dallo spazio, una leggera alterazione in una regione può influenzare drammaticamente la capacità dell’intero cuore di funzionare come sincitio17. Pertanto, l’imaging spatiotemporale elevato di coloranti sensibili ai parametri è uno strumento utile per monitorare la funzione cardiaca sulla superficie del cuore18,19. Infatti, la doppia imaging simultanea di sonde fluorescenti sensibili alla tensione e al calcio consente la valutazione dell’attività elettrica, la manipolazione del calcio e l’accoppiamento di contrazione di eccitazione a livello tissutale20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Le tecniche di mappatura langendorff-perfusione e/o ottica sono state precedentemente utilizzate per documentare il declino delle prestazioni cardiache dovuto all’invecchiamento o alle mutazioni genetiche e per valutare la sicurezza degli agenti farmacologici o delle esposizioni ambientali29 ,30,31,32,33.
In ambito clinico, uno studio di elettrofisiologia cardiaca invasivo viene spesso utilizzato per studiare disturbi del ritmo cardiaco, identificare patologie e individuare possibili opzioni di trattamento. Allo stesso modo, descriviamo un protocollo EP che può essere utilizzato per valutare la funzione del nodo del seno, misurare la conduzione atrioventricolare e identificare la refrattanza del tessuto miocardico. Lo studio EP descritto può essere eseguito in combinazione con la mappatura ottica, o optocardiografia34, per caratterizzare completamente la fisiologia cardiaca nei cuori isolati. Nel protocollo descritto, l’imaging a fluorescenza ad alta risoluzione spatiotemporale è stato eseguito con una combinazione di coloranti di tensione (RH237) e calcio (Rhod-2AM) in una configurazione a doppia emissione. Inoltre, i parametri di elettrofisiologia cardiaca sono stati monitorati sia sotto il ritmo del sinusale che in risposta alla stimolazione elettrica programmata.
Anche se i modelli di ricerca cardiovascolare vanno dai preparati cellulari ai preparati in vivo, c’è un compromesso intrinseco tra rilevanza clinica e utilità sperimentale. In questo spettro, il cuore isolato Langendorff-perfuso rimane un compromesso utile per studiare la fisiologia cardiaca48. L’intero modello cardiaco rappresenta un livello più elevato di integrazione funzionale e strutturale rispetto ai monostrati a cella singola o a tessuto, ma evita anche le complessità confuse associate ai modelli in vivo. Un grande vantaggio durante la doppia mappatura ottica è che la superficie epicardiale del cuore isolato può essere osservata, e l’imaging a fluorescenza del potenziale transmembrana e della manipolazione del calcio può essere utilizzato per monitorare la fisiologia cardiaca34.
I modelli di roditori sono più comunemente utilizzati per preparazioni cardiache isolate rispetto agli animali più grandi, in parte a causa del costo associato di up-sizing di tutti gli elementi coinvolti (ad esempio, volume della soluzione, circuito di perfusione, quantità di coloranti e disaccoppiatori meccanici) insieme a una maggiore instabilità e propensione per le aritmie in animali più grandi10,36,49. Un vantaggio dell’uso dei cuori di maiale è che assomigliano strettamente al cuore umano nella struttura, nelle dimensioni e nella velocità di contrazione, modellando quindi in modo più accurato parametri emodinamici come il flusso sanguigno coronavo e l’uscita cardiaca. Allo stesso modo, gli esseri umani e i maiali hanno una gestione simile del calcio, intervalli di elettrocardiogramma37e una morfologia potenziale di azione compresi i canali sottostanti che rappresenta12,50,51, 52. Questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la creazione di un modello animale di grandi dimensioni riproducibile per caratterizzare in modo completo la funzione miocardio. L’imaging simultaneo della tensione transmembrana (RH237) e del calcio intracellulare (Rhod2), utilizzato in combinazione con protocolli elettrofisiologici stabiliti, offre l’opportunità di individuare i meccanismi responsabili di Funzione. La metodologia descritta può essere utilizzata per test di sicurezza preclinici, screening tossicologico e lo studio di patologie genetiche o di altro tipo. Inoltre, la metodologia descritta può essere modificata e adattata per l’uso con altri modelli cardiaci (ad esempio, canino, umano) a seconda dello specifico focus di ricerca53,54,55.
Ci sono alcune modifiche critiche da tenere a mente quando si passa da un modello di roditore più piccolo a un modello di maiale più grande per preparazioni isolate e intere del cuore. Durante la preparazione e la configurazione, si consiglia di aggiungere albumina al perfusate per mantenere la pressione oncotica e ridurre l’edema (più antifoam, se necessario)56,57,58,59. Inoltre, la perfusate contenente albumina può anche aiutare in studi metabolici che richiedono anche il completamento dell’acido grasso ai media60,61. A differenza dei cuori dei roditori, il cuore di maiale più grande non ha bisogno di essere immerso nei supporti caldi a causa del suo rapporto superficie-volume più piccolo e dell’aumento del volume dei supporti riscaldati che scorre attraverso i vasi coronarici che meglio mantiene la temperatura. Come notato in precedenza, abbiamo posizionato sonde di temperatura all’interno del ventricolo destro e sulla superficie epicardiale dei ventricoli destro e sinistro, osservando solo lievi fluttuazioni di temperatura di 1o2 gradi centigradi in tutte e tre le posizioni in tutto lo studio. È importante sottolineare che tali flussi più veloci possono anche aumentare la probabilità di bolle e una potenziale embolia. Per aggirare questo problema, si consiglia di utilizzare una trappola a bolle con grandi tubi di foro che conducono direttamente alla cannula aortica. Allo stesso modo, abbiamo trovato più utile avere due individui che lavorano in tandem per cannulare l’aorta su un cuore più grande (e più pesante); una persona per tenere l’aorta aperta con robusti emostati e un’altra per fissare l’aorta alla canula con nastro ombelicale. Nella metodologia descritta, abbiamo scoperto che la perfusione con cardioplegia e defibrillazione era vitale per il recupero cardiaco, il che è contrario ai preparati cardiaci dei roditori. Nella nostra esperienza, solo pochi cuori ascisi ripresero la normale attività guidata dal sino senza cardioversione.
Per migliorare gli endpoint dell’imaging ottico, una preparazione del cuore appeso ha limitato l’effetto dell’abbagliamento che può verificarsi con un cuore sommerso. Inoltre, il cuore appeso evita anche qualsiasi compressione o compromesso dei vasi coronarici sull’aspetto posteriore del cuore che può verificarsi quando si posa il cuore orizzontalmente per l’imaging verticale. Abbiamo anche scoperto che il caricamento di coloranti fluorescenti dopo la trappola a bolle (vicino alla cannula aortica) ha notevolmente migliorato la colorazione dei tessuti e i segnali ottici. Infine, per migliorare gli endpoint di elettrofisiologia cardiaca, l’uso di un elettrodo di stimolazione coassiale più grande ha facilitato il pacing atriale di successo. Anche se descriviamo l’uso di elettrocardiogrammi per identificare la cattura e la perdita di cattura per vari parametri EP, possono essere utilizzati anche cateteri intracardiaci o elettrodi di registrazione bipolari.
Il nostro studio si è concentrato sullo sviluppo di una metodologia per la doppia mappatura ottica e la valutazione elettrofisiologica cardiaca in un modello di cuore di porcina isolato e intatto. A causa di somiglianze con il cuore umano giovanile, il cuore porcina rimane un modello popolare per gli studi incentrati sulla cardiologia pediatrica o difetti cardiaci congeniti. È importante sottolineare che l’approccio descritto può essere adattato per l’uso con cuori adulti di dimensioni maggiori e/o diverse specie di interesse. Infatti, altri laboratori possono scoprire che l’uso di cuori canini o umani (donatore o malato) sono più applicabili per il loro specifico focus di ricerca53,54,55. Un’altra potenziale limitazione a questo studio è l’uso di un disaccoppiatore meccanico per ridurre l’artefatto di movimento durante l’imaging. Blebbistatin è diventato lo scollegatore di scelta nelle applicazioni di imaging cardiaco grazie ai suoi effetti minimi sui parametri ECG, l’attivazione e i periodi refrattari41,62,63. BDM è una scelta meno costosa, che può essere particolarmente importante negli studi sugli animali di grandi dimensioni che richiedono maggiori volumi di perfusate e uncoupler meccanico, ma è noto per avere un maggiore impatto sulle correnti di potassio e calcio che possono alterare il potenziale di azione morfologia64,65,66,67. Se si utilizza BDM, si noti che l’accorciamento APD aumenta la vulnerabilità dei cuori agli arrythmias68indotti da urti . Al contrario, la principale limitazione all’uso della blebbistatin è la sua fotosensibilità e fototossicità, anche se formulazioni alternative che hanno ridotto questi effetti69,70,71. Infine, la metodologia descritta utilizza un unico sistema di telecamere per la doppia mappatura ottica, ma è importante notare che gli studi di ricerca si sono concentrati sulla fibrillazione ventricolare e/o sul tracciamento delle onde elettriche attraverso la superficie epicardiale dovrebbe modificare questo approccio per includere l’imaging panoramico tridimensionale, come descritto dagli altri15,19,72,73,74,75 .
The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono con gratitudine il Dr. Matthew Kay per una guida sperimentale utile, e Manelle Ramadan e Muhaymin Chowdhury per l’assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (R01HL139472 a NGP, R01 HL139712 a NI), Dall’Istituto nazionale di ricerca per bambini, dall’Istituto Nazionale del Cuore dei Bambini e dall’Istituto Sheikh s’ayed per l’innovazione chirurgica.
(-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560-5MG | Mechanical Uncoupler |
2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753-100G | Mechanical Uncoupler |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
Analog signal interface | emka Technologies | itf16USB | |
Antifoam | Sigma-Aldrich | A5758-250ML | |
Antifoam Y-30 Emulsion | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A5758 | |
Aortic cannula, 5/16” | Cole-Parmer | 45509-60 | |
Bubble trap | Sigma-Aldrich | CLS430641U-100EA | |
CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 | |
Camera, sCMOS | Andor Technology | Zyla 4.2 PLUS | |
Coaxial stimulation electrode (atria) | Harvard Apparatus | 73-0219 | |
Defibrillator | Zoll | M Series | |
Dichroic mirror | Chroma Technology | T660lpxrxt-UF2 | |
Differential amplifier | Warner Instruments | DP-304A | |
Emission filter, calcium | Chroma Technology | ET585/40m | |
Emission filter, voltage | Chroma Technology | ET710lp | |
EP stimulator (Bloom) | Fisher Medical | DTU-215B | |
Excitation filter | Chroma Technology | CT510/60bp | |
Excitation lights | Thorlabs | SOLIS-525C | |
Filter | McMaster-Carr | 8147K52 | |
Filter cartridge, polypropylene | Pentair | PD-5-934 | |
Filter housing | McMaster-Carr | 9979T21 | |
Flow transducer | Transonic | ME6PXN | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968 | |
Heating coil | Radnoti | 158821 | |
Hemofilter | Hemocor | HPH 400 | |
Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501326 | |
Image Splitter | Cairn Research | OptoSplit II | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 | |
Large-bore tubing, I.D. 3/8” | Fisher Scientific | 14-169-7H | |
Lens 50 mm, 0.95 f-stop | Navitar | DO-5095 | |
Metamorph | Molecular Devices | Image Alignment | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 | |
Mucasol detergent | Sigma-Aldrich | Z637181-2L | |
Na Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 | |
Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm | AD Instruments Inc. | MLA1204 | |
Noise eliminator | Quest Scientific | Humbug | |
Perfusion pump | PolyStan | A/S 1481 | |
Pressure transducer | World Precision Instruments | BLPR2 | |
Reservoir, 2 liter | Cole-Parmer | UX-34541-07 | |
RH237 | AAT Bioquest Inc. | 21480 | |
Rhod2-AM | AAT Bioquest Inc. | 21062 | |
Stimulation electrode (ventricle) | Harvard Apparatus | 73-0160 | |
Surgical Suture | McKesson Medical-Surgical | 890186 | |
Transducer amplifier | World Precision Instruments | TBM4M | |
Tubing flow console | Transonic | TS410 | |
Umbilical tape | Jorvet | J0025UA | |
Water bath/circulator | VWR | 89400-970 | |
Surgical Tools | |||
Bandage shears | Harvard Apparatus | 72-8448 | Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm |
Electrocautery | Dalwha Corp. Ltd. | BA2ALD001 | Model: 200 Basic |
Hemostat | Roboz | RS-7476 | St Vincent Tube Occluding Forceps |
Hemostatic forceps | Harvard Apparatus | 72-8960 | Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm |
Hemostats | Harvard Apparatus | 72-8985 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm |
Mayo scissors | WPI | 501749 | 14.5 cm, Straight |
Metzenbaum scissors | WPI | 501747 | 11.5 cm, Straight |
Mosquito forceps | Harvard Apparatus | 72-8980 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm |
Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8828 | Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length |
Pediatric cross clamp | Roboz | RS-7660 | Cooley-Derra Clamp 6.25" 5mm Calibrations |
Right angle forceps | WPI | 501240 | Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle |
Scalpel | Ted Pella | 549-4 | Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades |
scissors | Harvard Apparatus | 72-8380 | Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm |
Straight Serrated forceps | WPI | 500363 | Dressing Forceps 15.5cm |
Towel clamp | WPI | 501700 | Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS |
Weitlaner retractor | WPI | 501314 | Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2×3 Sharp Prongs |
Disposables | |||
3-0 prolene suture | Various vendors | Various vendors | |
Vessel loop | Aspen surgical | 011001PBX | Sterion® Vessel Loop, 0.8 x 406mm |
Cardioplegia (Plegisol) | Pfizer | 00409-7969-05 | Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg |
Heparin | Various vendors | Various vendors | 300 U/kg |
Syringe and Needle | Various vendors | Various vendors | 60mL & 18G respectively |
Umbilical tape | Ethicon | U12T |