Конструкция биосовместимого препарата-eluting Трахеальной стент в мышах с Laryngotracheal стеноз
Summary
Laryngotracheal стеноз результатом патологического осаждения рубцов, что критически сужает трахеи дыхательных путей и не хватает эффективной медицинской терапии. Используя стент PLLA-PCL (70% поли-L-лактида и 30% поликапролактон) в качестве местной системы доставки лекарств, можно изучить потенциальные методы лечения, направленные на уменьшение пролиферации шрамов в трахее.
Abstract
Laryngotracheal стеноз (LTS) является патологическим сужение субглоттиса и трахеи, ведущих к экстраторакальной обструкции и значительной одышки. LTS является результатом слизистой травмы от инородного тела в трахее, что приводит к повреждению тканей и местной воспалительной реакции, которая идет наперекосяк, что приводит к осаждению патологических рубцовой ткани. Лечение LTS является хирургическим из-за отсутствия эффективных медицинских методов лечения. Цель этого метода заключается в построении биосовместимого стента, который может быть миниатюризирован для размещения в мышей с LTS. Мы продемонстрировали, что конструкция PLLA-PCL (70% поли-Л-лактида и 30% поликапролактона) имела оптимальную биомеханическую прочность, была биосовместима, практически осуществима для стента размещения in vivo и способна принимать препарат. Этот метод обеспечивает систему доставки лекарств для тестирования различных иммуномодулирующих агентов для локального ингибирования воспаления и снижения фиброза дыхательных путей. Изготовление стентов занимает 28-30 ч и может быть воспроизведено легко, что позволяет проводить эксперименты с большими когортами. Здесь мы включили препарат рапамицин в стент, чтобы проверить его эффективность в снижении фиброза и осаждения коллагена. Результаты показали, что палатки PLLA-PCL показали надежное высвобождение рапамицина, были механически стабильными в физиологических условиях и были биосовместимы, вызывая небольшую воспалительную реакцию в трахеееи. Кроме того, рэпамицин-eluting PLLA-PCL стенты снижение образования рубцов в трахеи in vivo.
Introduction
Laryngotracheal стеноз (LTS) является патологическим сужение трахеи чаще всего из-за ятрогенной после интубации травмы. Сочетание бактериальной колонизации, реакции инородного тела на трахеостомию или эндотрахеальную трубку, а также специфические факторы пациента приводят к аномальной воспалительной реакции. Этот неадаптивный иммунный ответ приводит к осаждению коллагена в трахее, что приводит к сужению стены и последующему стенозу1,2. В настоящее время лечение этого заболевания в первую очередь хирургическое, разработка альтернативной медицинской парадигмы лечения ориентации аномальных воспалительных и профиброзных путей, которые приводят к чрезмерному осаждению коллагена была изучена. Рапамицин, который ингибирует mTOR сигнальный комплекс, было показано, что иммуносупрессивные эффекты, а также надежный эффект антифибробластов. Однако, когда рапамицин системно вводят, общие побочные эффекты (например, гиперлипидемия, анемия, тромбоцитопения) могут быть произнесены3. Цель нашей методологии заключается в разработке транспортного средства для местной доставки лекарств, осуществимых для использования в дыхательных путих, что позволит ухудшить эти системные эффекты. Наши оценки сосредоточены на изучении местного иммунного ответа на конструкцию доставки лекарств, а также его способности подавлять функцию фибробластов и изменять местную иммунную микросреду. Специфические результаты болезни включают тестирование in vivo, которое оценивает маркеры фиброза.
Биоразлагаемые медикаментозно-элютные стенты использовались в животных моделях болезней в системах залпового огня, в том числе в дыхательных путях4. Для управления стенозом дыхательных путей или коллапса, предыдущие исследования использовали сатрики с наркотического покрытия и никель основе стентов5. Конструкция PLLA-PCL была выбрана для этого конкретного метода из-за его профиля elution снадобья и механической прочности в физиологических условиях над периодом 3 неделей, которая была продемонстрирована в предыдущих опубликованных изучениях6. PLLA-PCL также является биосовместимым и биоразлагаемым материалом, уже одобренным FDA4. Биосовместимые стенты, eluting цисплатин и MMC были изучены в крупных животных моделей, таких как кролики и собаки. Однако, в этих животных моделях, стенты не были помещены в животной модели болезни и были имплантированы трансцервически. Это исследование предоставляет уникальный метод для оценки биосовместимых наркотиков eluting стент помещен трансорально в мышиной модели повреждения дыхательных путей и laryngotracheal стеноз. Биосовместимый стент, который выражает иммуномодулирующий препарат локально и может быть миниатюризирован для изучения в модели мурина, ценен для трансляционных доклинических исследований. Предыдущие попытки использования стента с другими материальными конструкциями генерировали надежные реакции инородного тела, ухудшающие основное воспаление, которое отличает LTS7. Эта методология, насколько нам известно, является первой в своем роде для изучения иммуномодулирующих и антифибротических эффектов системы доставки стентов в модели murine LTS. Сама модель мурин предлагает ряд преимуществ для изучения влияния иммуномодулирующего препарата на трахею. Генетически модифицированные мыши и экспериментальные когорты здоровых и больных мышей могут быть изучены, что может привести к экспериментальной воспроизводимости и повышению рентабельности. Более того, доставка стента трансорально в трахею мыши имитирует клиническую доставку такого стента у человека, что еще больше подчеркивает переводное преимущество этого метода. Наконец, относительная легкость, с которой PLLA-PCL стент с препаратом может быть произведена позволяет модификации для доставки альтернативных методов лечения наркотиков, направленных на снижение образования рубцов в трахеи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важными шагами для успешного построения и использования медикаментозного стента in vivo являются 1) определение оптимального соотношения PLLA-PCL для желательной скорости униции препарата, 2) определение соответствующей концентрации препарата, который будет выслан, 3) литье стентов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Национальный институт по глухоте и другим коммуникационным расстройствам Национальных институтов здравоохранения под номерами премии 1K23DC014082 и 1R21DC017225 (Александр Хиллель). Это исследование также получило финансовую поддержку Триологического общества и Американского колледжа хирургов (Александр Хиллель), Американской медицинской ассоциации Фонда, Чикаго, IL (Madhavi Duvvuri) и T32 NIDCD учебный грант (Кевин Мотц).
Materials
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA “finger-type” stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
