La coltura aggregata adipocite matura membrana (MAAC) è un nuovo metodo per coltivare adipociti umani maturi. Qui dettagliamo come isolare gli adipociti dall’adiposo umano e come impostare il MAAC.
La disregolazione del tessuto adiposo bianco (WAT) svolge un ruolo centrale nello sviluppo dell’insulino-resistenza e del diabete di tipo 2 (T2D). Per sviluppare nuovi trattamenti per il T2D, sono necessari modelli di adipociti in vitro più rilevanti dal modo fisiologico. Questo studio descrive una nuova tecnica per isolare e la coltura matura adipociti umani. Questo metodo è intitolato MAAC (membrana matura coltura aggregata adipocito), e rispetto ad altri modelli di adipocite in vitro, MAAC possiede una firma genica adipogenica che è la più vicina agli adipociti maturi appena isolati. Utilizzando MAAC, gli adipociti possono essere coltivati da pazienti magri e obesi, diversi depositi adiposi, co-coltivati con diversi tipi di cellule e, soprattutto, possono essere tenuti in coltura per 2 settimane. Esperimenti funzionali possono essere eseguiti anche su MAAC tra cui assorbimento del glucosio, lipogenesi, e lipolisi. Inoltre, MAAC risponde robustamente all’agonia farmacologica diversificata e può essere utilizzato per studiare i cambiamenti fenotipici adipociti, compresa la transdifferenziazione degli adipociti bianchi in cellule adipose marroni.
L’aumento mondiale delle co-morbidità legate all’obesità e all’obesità richiede lo sviluppo di nuove terapie. Il tessuto adiposo bianco (WAT) è un importante regolatore del metabolismo di tutto il corpo, l’omeostasi energetica ed è un attore centrale nello sviluppo dell’insulino-resistenza e del diabete di tipo 2 (T2D)1,2. Durante il consumo cronico di calorie in eccesso, gli adipociti si ingrandiscono per gestire l’eccedenza di energia. Tuttavia, la capacità di stoccaggio dei lipidi adipociti può essere superata, con conseguente elevazione dei livelli circolanti di acidi grassi e aumento dello stoccaggio nei tessuti non adiposi periferici e portando alla lipotossicità3,4.
La mancanza di modelli adipociti in vitro con elevata rilevanza traslazionale è una sfida fondamentale nello sviluppo di nuovi trattamenti per l’obesità e il T2D. Il modello ex vivo ex-explant, in cui vengono coltivati piccoli pezzi di tessuto adiposo, è associato a rapide alterazioni dell’espressione genica adipogenica causate da ipossia e infiammazione5,6. Colture del soffitto (CC) dove gli adipociti maturi galleggiano e aderiscono alla parte superiore dei flaconi pieni di media, rapidamente didifferenziarsi in cellule simili a fibroblasti prive di lipidi7,8,9,10. Il modello più comunemente usato è gli adipociti differenziati in vitro dai precursori impegnati. Le cellule differenziate sono, tuttavia, morfologicamente distinte dagli adipociti maturi in vivo poiché sono molto più piccole e non hanno una goccia di lipidi unsuoculare. Altre limitazioni con questo modello includono la necessità non fisiologica di un cocktail chimico per guidare la differenziazione, così come la variabilità nell’efficienza di differenziazione che può essere influenzata da una serie di fattori11,12,13,14.
Recentemente abbiamo sviluppato la coltura aggregita adipocite a membrana matura (MAAC), un metodo per la coltura a lungo termine di adipociti maturi appena isolati, dove gli adipociti sono coltivati sotto membrane permeabili10. L’analisi imparziale dei dati di sequenziamento dell’RNA ha dimostrato che rispetto agli esoti dei tessuti adiposi e agli adipociti differenziati in vitro, il MAAC è più simile agli adipociti appena isolati. MAAC può essere utilizzato per coltura adipociti maturi isolati dal tessuto adiposo sottocutaneo e viscerale, così come adipociti da soggetti obesi e magri. Questa metodologia consente lo studio dei cambiamenti fenotipici adipociti a lungo termine e facilita la co-coltura degli adipociti con altri tipi di cellule. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l’isolamento degli adipociti maturi dal tessuto adiposo umano e come impostare il sistema MAAC.
La coltura aggregata adipocite matura membrana (MAAC) è un nuovo metodo per la cultura a lungo termine degli adipociti maturi appena isolati. Nella creazione di MAAC ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo che influenzano notevolmente la resa, la qualità e la fattibilità degli adipociti maturi. Molto sforzo dovrebbe essere messo a mincing il grasso nel passo 3.2 dal momento che questo passaggio influenza direttamente la quantità di tempo gli adipociti sono esposti al collagenasi. Se i pezzi di adiposo sono troppo grandi, il tempo di digestione dovrà essere esteso che influisce negativamente sulla vitalità delle cellule. Al contrario, se il tessuto viene lavorato troppo finemente con le forbici, anche la vitalità può essere influenzata. Per una cultura di successo degli adipociti maturi come MAAC, si dovrebbe prestare particolare attenzione ai seguenti passaggi: per la seeding di successo degli adipociti sulle membrane, è fondamentale che il buffer di lavaggio dei lipidi e di riporto libero venga rimosso dagli adipociti maturi nei passaggi 5.3 e 5.4. Il buffer di lipidi o lavaggi rimanenti ridurrà la tensione superficiale degli adipociti e aumenterà il rischio di gocciolare adipociti delle membrane quando vengono capovolti. Quando gli adipociti sono semi e nei media, le cellule rimangono a contatto con la membrana principalmente attraverso la galleggiabilità, quindi si raccomanda una tecnica lenta e delicata quando si cambia noto multimediale per non perdere le cellule. Rimuovere i supporti dalla parte inferiore dei pozzi come descritto al punto 7.1 e aggiungere i supporti con il pipettaggio lento dei supporti lungo i lati delle pareti. Infine, un suggerimento di risparmio di tempo è quello di preparare le piastre con supporti e trattamenti prima del processo di isolamento degli adipociti. In particolare per progetti sperimentali complessi, pre-preparare le piastre può risparmiare molto tempo e garantire che gli adipociti siano collocati in supporti con i loro trattamenti non appena sono isolati.
Un vantaggio dell’utilizzo di MAAC rispetto a differenziare i preadipociti è che il supporto MAAC utilizzato è molto semplice e non richiede un cocktail di ormone non fisiologico. Qui abbiamo coltivato MAAC in supporti ricchi di glucosio (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn/strep e 20 nM di insulina. È importante sottolineare che abbiamo scoperto che l’insulina è assolutamente necessaria per l’induzione guidata da rosiglitazone/pioglitazone di UCP110. L’insulina, tuttavia, non è necessaria per mantenere il fenotipo adipogenico delle cellule. Pertanto, a seconda della domanda sperimentale, l’insulina può essere inclusa o omessa.
La procedura descritta sopra è stata ottimizzata per l’isolamento e la cultura degli adipociti umani. Tuttavia, il topo, e possibilmente gli adipociti di altri organismi, può anche essere coltivato come MAAC. Se gli adipociti del topo devono essere colti come MAAC ci sono ulteriori considerazioni e precauzioni che dovrebbero essere tenute a mente. Abbiamo scoperto che gli adipociti maturi dei topi sono molto più fragili di quelli provenienti dall’uomo. Di conseguenza, il tempo di digestione deve essere ridotto al minimo assoluto per aumentare la vitalità cellulare. Abbiamo anche scoperto che gli adipociti dei topi giovani (8 settimane e più giovani) fornivano i risultati più robusti e riproducibili. Infine, il topo MAAC può essere coltivato fino a una settimana, tuttavia dato che il loro fenotipo adipogenico appare meno stabile rispetto agli esseri umani (che possono essere coltivati attraverso almeno due settimane) si consiglia di coltivare il mouse MAAC per il tempo minimo richiesto per affrontare domande sperimentali.
Poiché il modello MAAC si basa sull’utilizzo di membrane permeabili, un vantaggio di questa tecnica è la possibilità di co-codificare gli adipociti maturi con altri tipi di cellule. In precedenza abbiamo dimostrato la capacità di adipociti maturi e macrofagi di incrociare attraverso l’uso di MAAC10. Questo apre opportunità per esplorare ulteriormente il legame tra obesità, insulino-resistenza e risposte immunitarie15,16,17. Esperimenti futuri potrebbero incorporare altri tipi di cellule come epatociti, preadipociti, cellule endoteliali o cellule pancreatiche per aumentare ulteriormente la complessità e la rilevanza traslazionale del modello MAAC e studiare il crosstalk tra più tipi di cellule.
Anche se MAAC ha dimostrato di essere superiore nel mantenere la funzionalità e l’identità degli adipociti rispetto ad altri modelli adipociti in vitro, ha anche limitazioni che devono essere considerate. Rispetto all’utilizzo di adipociti differenziati dalle cellule precursori, IL MAAC è un modello più laborioso e dispendioso in termini di tempo. Le piastre con membrane sono anche più costose rispetto alle normali piastre di coltura cellulare. È importante sottolineare che gli adipociti maturi devono essere appena isolati ogni volta al momento della semina e non possono essere espansi o congelati in scorte come le cellule precursori. Pertanto, questo richiede l’accesso a campioni di tessuto adiposo bianco fresco, ma aggiunge anche un livello di complessità derivante dalle variazioni donatrice a donatrice.
Qui abbiamo presentato un protocollo dettagliato per isolare gli adipociti maturi umani e la creazione di MAAC. Abbiamo dimostrato che gli adipociti coltivati come MAAC rimangono vitali per due settimane, la loro firma genica adipogenica è preservata e rispondono all’agonismo farmacologico diversificato. L’uso di MAAC consente lo studio degli adipociti del betweeen cross-talk e di altri tipi di cellule, e la valutazione dei cambiamenti fenotipici a lungo termine degli adipociti maturi in risposta a diversi stimoli.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Xiao-Rong Peng e Stefan Hallen per aver fornito risorse e ottimizzato l’isolamento degli adipociti, Martin Uhrbom per l’assistenza tecnica e Daniel Olausson e Malin L’nn per aver coordinato e fornito l’umano.
Autoclaved scissors | |||
Autoclaved spoons | |||
Autoclaved tweezers | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Conical tubes, 50 mL | |||
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needles, 18G, 1.20×40 mm | Sterican | 613-2948 | |
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
Petri dishes, 150×21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
Shaking incubator (37 °C) | |||
Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
Transwells, 24-well (6,5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |