A cultura agregada madura de membrana (MAAC) é um novo método para cultivar adipócitos humanos maduros. Aqui detalhamos como isolar adipócitos do adipose humano e como configurar o MAAC.
A disregulação do tecido adiposo branco (WAT) desempenha um papel central no desenvolvimento da resistência à insulina e diabetes tipo 2 (T2D). Para desenvolver novos tratamentos para T2D, são necessários modelos de adipocito in vitro mais fisiologicamente relevantes. Este estudo descreve uma nova técnica para isolar e cultivar adipócitos humanos maduros. Este método é intitulado MAAC (cultura adipocito madura de membrana), e comparado a outros modelos in vitro adipocitos, o MAAC possui uma assinatura genética adipogênica que é a mais próxima de adipócitos maduros recém-isolados. Usando MAAC, os adipócitos podem ser cultivados a partir de pacientes magros e obesos, diferentes depósitos adiposos, co-cultivados com diferentes tipos de células e, principalmente, podem ser mantidos na cultura por 2 semanas. Experimentos funcionais também podem ser realizados no MAAC, incluindo captação de glicose, lipogênese e lipolisse. Além disso, o MAAC responde robustamente ao agonismo farmacológico diversificado e pode ser usado para estudar alterações de adipocito eadipocito, incluindo a transdiferenciação de adipocitos brancos em células de gordura marrom.
O aumento mundial das comorbidades relacionadas à obesidade e à obesidade requer o desenvolvimento de novas terapêuticas. O tecido adiposo branco (WAT) é um importante regulador do metabolismo do corpo inteiro, homeostase energética, e é um player central no desenvolvimento da resistência à insulina e diabetes tipo 2 (T2D)1,2. Durante o consumo crônico de calorias em excesso, os adipócitos aumentam para lidar com o excedente de energia. No entanto, a capacidade de armazenamento lipídico adipocito pode ser excedida, resultando em uma elevação dos níveis circulantes de ácidos graxos e aumento do armazenamento em tecidos periféricos não adippose e levando à lipotoxicidade3,4.
A falta de modelos in vitro adipocitos com alta relevância translacional é um desafio fundamental no desenvolvimento de novos tratamentos para obesidade e T2D. O modelo exvivo explant, onde pequenos pedaços de tecido adipo são cultivados, está associado a alterações rápidas na expressão genética adipogênica impulsionada pela hipóxia e inflamação5,6. Culturas de teto (CCs) onde os adipócitos maduros flutuam e aderem ao topo dos frascos cheios de mídia, rapidamente desdiferenciam-se em células semelhantes a fibroblastos sem lipídio7,8,9,10. O modelo mais usado são adipócitos diferenciados in vitro de precursores comprometidos. As células diferenciadas são, no entanto, morfologicamente distintas dos adipócitos maduros in vivo, uma vez que são muito menores em tamanho e carecem de gotícula lipídica não ilócula. Outras limitações com este modelo incluem a necessidade não fisiológica de um coquetel químico para conduzir a diferenciação, bem como a variabilidade na eficiência da diferenciação que pode ser afetada por uma série de fatores11,12,13,14.
Desenvolvemos recentemente a cultura adipocito madura de membrana (MAAC), um método para a cultura de longo prazo de adipócitos maduros recém-isolados, onde os adipócitos são cultivados membranas permeáveis10. A análise imparcial dos dados de sequenciamento de RNA mostrou que em relação às explantas de tecido adipposados e adipócitos in vitro diferenciados, o MAAC é mais semelhante aos adipócitos recém-isolados. O MAAC pode ser usado para cultivar adipócitos maduros isolados tanto de tecido adipano subcutâneo quanto visceral, bem como adipócitos de indivíduos obesos e magros. Essa metodologia permite o estudo de alterações adipocitos adipocitos adipocitos de longo prazo e facilita a co-cultura de adipócitos com outros tipos de células. Aqui fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de adipócitos maduros do tecido adippose humano e como configurar o sistema MAAC.
A cultura adipocito madura da membrana (MAAC) é um novo método para a cultura de longo prazo de adipócitos maduros recém-isolados. Na criação do MAAC, existem alguns passos críticos no protocolo que impactam muito o rendimento, a qualidade e a viabilidade dos adipócitos maduros. Muito esforço deve ser colocado para picar a gordura na etapa 3.2, uma vez que esta etapa influencia diretamente na quantidade de tempo que os adipócitos são expostos à colagenase. Se os pedaços de adipose forem muito grandes, o tempo de digestão terá que ser estendido, o que impacta negativamente a viabilidade das células. Por outro lado, se o tecido for processado muito bem com uma tesoura, a viabilidade também pode ser impactada. Para uma cultura bem sucedida de adipócitos maduros como MAAC, deve-se dar atenção especial aos seguintes passos: para a semeação bem sucedida dos adipócitos nas membranas, é crucial que o protetor de labuta lipídico livre e de transporte seja removido dos adipócitos maduros nos passos 5.3 e 5.4. O lipídio ou tampão de lavagem restante reduzirá a tensão superficial dos adipócitos e aumentará o risco de adipócitos pingando as membranas quando são virados. Quando os adiócitos são semeados e na mídia, as células permanecem em contato com a membrana principalmente através da flutuação, assim, recomenda-se uma técnica lenta e suave ao mudar a mídia para não perder células. Remova a mídia da parte inferior dos poços, conforme descrito na etapa 7.1 e adicione mídia, canalizando lentamente os meios de comunicação pelas laterais das paredes. Por fim, uma sugestão de economia de tempo é preparar as placas com mídia e tratamentos antes do processo de isolamento adipócito. Particularmente para projetos experimentais complexos, a pré-preparação das placas pode economizar muito tempo e garante que os adiócitos sejam colocados na mídia com seus tratamentos assim que estiverem isolados.
Um benefício do uso do MAAC em comparação com os preadipócitos diferenciados é que a mídia MAAC usada é muito simples e não requer um coquetel hormonal não fisiológico. Aqui temos maac cultivado em mídia rica em glicose (DMEM/F12), 10% FBS, 1% penn/estrep, e 20 nM insulina. É importante ressaltar que a insulina é absolutamente necessária para a indução impulsionada pela rosiglitazone/pioglitazone do UCP110. A insulina, no entanto, não é necessária para manter o fenótipo adipogênico das células. Assim, dependendo da questão experimental, a insulina pode ser incluída ou omitida.
O procedimento detalhado acima foi otimizado para o isolamento e cultura dos adipócitos humanos. No entanto, o rato, e possivelmente os adipócitos de outros organismos, também podem ser cultivados como MAAC. Se os adipócitos do camundongo devem ser cultivados como MAAC, há considerações adicionais e precauções que devem ser mantidas em mente. Descobrimos que adipócitos maduros de camundongos são muito mais frágeis do que os humanos. Como resultado, o tempo de digestão deve ser reduzido para um mínimo absoluto para aumentar a viabilidade celular. Também descobrimos que os adipócitos de camundongos jovens (8 semanas de idade e mais jovens) forneceram os resultados mais robustos e reprodutíveis. Por fim, o mouse MAAC pode ser cultivado por até uma semana, no entanto, dado que seu fenótipo adipogênico parece menos estável do que os humanos (que podem ser cultivados ao longo de pelo menos duas semanas) recomendamos o rato de culturing MAAC pelo tempo mínimo necessário para abordar questões experimentais.
Uma vez que o modelo MAAC é baseado no uso de membranas permeáveis, uma vantagem dessa técnica é a possibilidade de co-culturing os adipócitos maduros com outros tipos de células. Já demonstramos anteriormente a capacidade de adipócitos maduros e macrófagos para falar cruzado através do uso do MAAC10. Isso abre oportunidades para explorar ainda mais a ligação entre obesidade, resistência à insulina e respostas imunes15,16,17. Experimentos futuros poderiam incorporar outros tipos de células, como hepatocitos, preadipócitos, células endoteliais ou células pancreáticas para aumentar ainda mais a complexidade e a relevância translacional do modelo MAAC e investigar crosstalk entre vários tipos de células.
Embora o MAAC tenha se mostrado superior na manutenção da funcionalidade e identidade dos adipócitos em relação a outros modelos in vitro adipócitos, ele também tem limitações que precisam ser consideradas. Em comparação com o uso de adiócitos diferenciados das células precursoras, o MAAC é um modelo mais trabalhoso e demorado. Placas com membranas também são mais caras em comparação com placas regulares de cultura celular. É importante ressaltar que os adipócitos maduros precisam ser recém-isolados a cada vez após a semeação e não podem ser expandidos ou congelados em estoques como células precursoras. Assim, isso requer ter acesso a amostras frescas de tecido adiposo branco, mas também adiciona um nível de complexidade decorrente de variações de doadores a doadores.
Aqui apresentamos um protocolo detalhado para isolar adipócitos maduros humanos e configurar o MAAC. Demonstramos que os adipocitos cultivados como MAAC permanecem viáveis ao longo de duas semanas, sua assinatura genética adipogênica é preservada, e eles respondem ao agonismo farmacológico diverso. O uso do MAAC permite o estudo de adipócitos betweeen e outros tipos de células, e a avaliação de mudanças pénotipicas de longo prazo de adipócitos maduros em resposta a diferentes estímulos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Xiao-Rong Peng e Stefan Hallen por fornecerrecursos e otimizar o isolamento adipócito, Martin Uhrbom por assistência técnica, e Daniel Olausson e Malin Lönn por coordenar e fornecer o adipose humano.
Autoclaved scissors | |||
Autoclaved spoons | |||
Autoclaved tweezers | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Conical tubes, 50 mL | |||
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needles, 18G, 1.20×40 mm | Sterican | 613-2948 | |
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
Petri dishes, 150×21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
Shaking incubator (37 °C) | |||
Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
Transwells, 24-well (6,5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |