खमीर विषाक्तता और दमन स्क्रीन का उपयोग कर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते की पहचान
Summary
जीवाणु रोगजनक मेजबान में प्रोटीन स्रावित करते हैं जो महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को लक्षित करते हैं। जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते की पहचान आणविक रोगजनन को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, विषाक्त जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते स्पष्ट करने के लिए एक संशोधित खमीर suppressor और विषाक्तता स्क्रीन का उपयोग कर एक विधि का वर्णन किया गया है.
Abstract
इंट्रासेल्यूलर बैक्टीरिया उग्रता कारकों को होस्ट साइटोसोल में प्रभावक प्रोटीन कहते हैं जो मेजबान प्रोटीन को नष्ट करने का कार्य करते हैं और/या जीवाणु के लाभ के लिए उनके संबद्ध जैविक रास्ते। putative बैक्टीरियल प्रभावक प्रोटीन की पहचान जीवाणु जीनोम अनुक्रमण में प्रगति और एल्गोरिदम के आगमन के कारण अधिक प्रबंधनीय हो गया है कि जीन एन्कोडिंग स्राव उम्मीदवारों की सिलिको पहचान में अनुमति देते हैं और / डोमेन. हालांकि, इन महत्वपूर्ण उग्र कारकों की पहचान केवल एक प्रारंभिक कदम है। स्वाभाविक रूप से, लक्ष्य प्रभावक प्रोटीन के आणविक समारोह का निर्धारण और स्पष्ट कैसे वे मेजबान के साथ बातचीत है. हाल के वर्षों में, खमीर दो-हाइब्रिड स्क्रीन और बड़े पैमाने पर इम्यूनोवेरेक्शन जैसी तकनीकों ने मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान में सहायता की है। हालांकि एक मेजबान बाध्यकारी साथी की पहचान एक जीवाणु प्रभावक प्रोटीन के आणविक समारोह स्पष्ट करने की ओर महत्वपूर्ण पहला कदम है, कभी कभी मेजबान प्रोटीन कई जैविक कार्य किया है पाया जाता है (उदा., actin, clathrin, tubulin), या जीवाणु प्रोटीन शारीरिक रूप से मेजबान प्रोटीन बाँध नहीं हो सकता है, सटीक मेजबान मार्ग के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी के शोधकर्ता वंचित हेरफेर किया जा रहा है. एक संशोधित खमीर विषाक्तता स्क्रीन एक दमन स्क्रीन के साथ मिलकर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन से प्रभावित मेजबान रास्ते की पहचान करने के लिए अनुकूलित किया गया है. विषाक्तता स्क्रीन मेजबान जैविक रास्ते, जो अक्सर एक विकास दोष के रूप में प्रकट होता है के साथ हस्तक्षेप प्रभावक प्रोटीन की वजह से खमीर में एक विषाक्त प्रभाव पर निर्भर करता है. एक खमीर जीनोमिक पुस्तकालय की अभिव्यक्ति मेजबान कारकों है कि जीवाणु प्रभावक प्रोटीन की विषाक्तता को दबाने और इस प्रकार मार्ग है कि प्रभावक प्रोटीन लक्ष्य में प्रोटीन की पहचान की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल दोनों विषाक्तता और suppressor स्क्रीन के लिए विस्तृत निर्देश शामिल हैं. इन तकनीकों को किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है जो आणविक क्लोनिंग और खमीर और एस्चेरीचिया कोलीकी खेती करने में सक्षम हो सकती है .
Introduction
यहाँ प्रस्तुत उन लोगों के समान प्रक्रियाओं की पहली रिपोर्ट Legionella न्यूमोफिला प्रकार चतुर्थ प्रभावक SidD, एक deAMPylase कि Rab11को संशोधित करता है विशेषता है. अनेक एल न्यूमोफिला प्रभावक1,2,3की विशेषता के लिए तुलनात्मक तकनीकों का प्रयोग किया गया . परख एक Coxiella burnetii प्रकार चतुर्थ प्रभावक प्रोटीन4की विशेषता के लिए अनुकूलित किया गया था , और हाल ही में इस तकनीक की उपयोगिता क्लैमिडिया trachomatis शामिल झिल्ली प्रोटीन प्रोटीन के लक्षण के लिए विस्तार किया गया था5 .
इस प्रोटोकॉल दो प्रमुख भागों में टूट सकता है: 1) खमीर विषाक्तता स्क्रीन, जिसमें ब्याज के जीवाणु प्रभावक प्रोटीन खमीर और क्लोन में व्यक्त की है एक विषाक्त phenotype के लिए एक विकास दोष द्वारा सबूत के रूप में जांच कर रहे हैं, और 2) खमीर suppressor स्क्रीन , जिसमें विषाक्त phenotype विषाक्त तनाव में एक खमीर जीनोमिक पुस्तकालय की अभिव्यक्ति द्वारा दबा दिया है. इस प्रकार, विषाक्तता स्क्रीन विषाक्त phenotypes कि विकास दोष के रूप में प्रकट जब ब्याज के जीवाणु प्रभावक overexpressed है के लिए एक स्क्रीन है. विषाक्त क्लोन, सफलतापूर्वक के साथ बदल दिया और जीवाणु प्रभावक व्यक्त, चयनित और अगले कदम के लिए बचाया जाता है. दूसरा बड़ा कदम विषाक्त खमीर क्लोन में एक आंशिक रूप से पचा खमीर जीनोमिक पुस्तकालय overexpressing शामिल है. इस प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए सुझाए गए खमीर जीनोमिक लाइब्रेरी बनाने वाले प्लासमिड्स ले 5 “20 केबी आवेषण, आमतौर पर सभी प्लाज्मिड में $ 1.5 केबी के औसत जीन आकार के 3 “13 खमीर ओपन रीडिंग फ्रेम (ORF) के अनुरूप होते हैं, पूरे खमीर जीनोम को कवर करते हुए लगभग 10x. परख के इस भाग को दमनकर्ता स्क्रीन कहा जाता है, क्योंकि लक्ष्य जीवाणु प्रभावक प्रोटीन की विषाक्तता को दबाना है। संभावित suppressor प्लाज्मिड खमीर से अलग कर रहे हैं, अनुक्रम, और दबाने ORFs की पहचान की. दबानेवाला स्क्रीन अंतर्निहित तर्क यह है कि effector प्रोटीन बांधता है, के साथ सूचना का आदान प्रदान, और / या मेजबान मार्ग यह लक्ष्य के घटकों डूब, और है कि उन मेजबान प्रोटीन अतिरिक्त में वापस उपलब्ध कराने के रास्ते पर विषाक्त प्रभाव बचाव कर सकते हैं और इस प्रकार, विकास दोष. इस प्रकार, पहचान ORFs कि विषाक्तता को दबाने अक्सर एक मेजबान मार्ग के कई प्रतिभागियों का प्रतिनिधित्व करते हैं. ऑर्थोगोनल प्रयोगों तो सत्यापित करने के लिए किया जाता है कि जीवाणु प्रभावक वास्तव में फंसा हुआ मार्ग के साथ सूचना का आदान प्रदान. यह विशेष रूप से आवश्यक है अगर इस तरह के clathrin या actin के रूप में एक बाध्यकारी साथी की पहचान की गई है, क्योंकि इन प्रोटीन मेजबान प्रक्रियाओं की एक भीड़ में शामिल हैं. इसके बाद और प्रयोग संक्रमण के दौरान प्रभावक प्रोटीन के शारीरिक समारोह को स्पष्ट कर सकते हैं। विषाक्तता और दमन स्क्रीन भी जीवाणु effector प्रोटीन है कि शारीरिक रूप से इम्यूनोवर्षा द्वारा पता लगाने के लिए पर्याप्त affinities के साथ मेजबान प्रोटीन बाँध नहीं है या कि के साथ बातचीत के शारीरिक समारोह को समझने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं एंजाइमी हिट-एंड-रन इंटरैक्शन में होस्ट जो खमीर-दो हाइब्रिड स्क्रीन द्वारा नहीं पता लगाया जा सकता है।
हालांकि suppressor स्क्रीन जीवाणु प्रभावक प्रोटीन और मेजबान रास्ते के बीच संभावित शारीरिक बातचीत प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका हो सकता है, जीवाणु effector प्रोटीन खमीर में एक विकास दोष प्रेरित करना चाहिए, अन्यथा में यह प्रयोग निरोधक स्क्रीन कम उपयोग की होगी. इसके अलावा, विषाक्त phenotype में परिणाम होना चाहिए कम से कम एक 2 “3 लॉग10 विकास में कमी या यह suppressors की पहचान करने के लिए मुश्किल हो जाएगा. यदि एक प्रयोगशाला सेल संस्कृति के लिए स्थापित किया गया है, ऐसे HeLa के रूप में आम सेल लाइनों में विषाक्तता के लिए प्रभावक प्रोटीन स्क्रीनिंग अक्सर के रूप में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं कि क्या यह खमीर विषाक्तता स्क्रीन के साथ आगे बढ़ने के प्रयास के लायक है. Hela कोशिकाओं में प्रभावक प्रोटीन के अस्थानिक अभिव्यक्ति कभी कभी विषाक्तता में परिणाम है कि इन स्क्रीन4के लिए इस्तेमाल खमीर तनाव में विषाक्तता के साथ बहुत दृढ़ता से संबंधित है . HeLa कोशिकाओं में तनाव की प्रेक्षणीय पहचान तनाव फाइबर की हानि, थाली से सेल टुकड़ी, और परमाणु संघनन apoptosis का संकेत शामिल हैं. HeLa कोशिकाओं में तनाव के किसी भी दृश्य संकेत ब्याज की प्रोटीन खमीर में एक विकास दोष है, जो और अधिक तेजी से दोहराने और इस प्रकार आवश्यक रास्ते के क्षोभ के लिए अधिक उत्तरदायी हैं प्रेरित करने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बनाते हैं.
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि दबानेवाला स्क्रीन हमेशा suppressors के रूप में मेजबान बाध्यकारी भागीदारों की पहचान नहीं करता है, लेकिन यह अभी भी मेजबान मार्ग के महत्वपूर्ण घटकों को फंसा सकते हैं (ओं) लक्षित, जैविक प्रक्रियाओं के एक समग्र दृष्टिकोण उपज द्वारा अपहरण कर लिया जा रहा है जीवाणु प्रभावक प्रोटीन. सतह पर, यह counterintuitive लगता है, क्योंकि अतिरिक्त में effector प्रोटीन के बंधन साथी प्रदान करने के लिए विकास दोष बचाव की उम्मीद की जाएगी. सी trachomatis effector प्रोटीन CT229 (CpoS) द्वारा लक्षित रास्ते की पहचान करने के प्रयासों में, जो संक्रमण के दौरान कम से कम 10 विभिन्न Rab GTPases को बांधताहै 5, Rab बाध्यकारी भागीदारों में से कोई भी CT229 की विषाक्तता को दबा दिया. हालांकि, clathrin लेपित vesicle (CCV) तस्करी में शामिल कई suppressors की पहचान की गई, जो आगे काम करने के लिए प्रदर्शन है कि CT229 विशेष रूप से राब निर्भर CCV तस्करी subverts. इसी तरह, जब सी burnetii प्रभावक प्रोटीन Cbu0041 (CirA) कई Rho GTPases कि खमीर विकास दोष बचाया की जांच की पहचान की गई, और यह बाद में पाया गया कि CirA एक GTPasse के रूप में कार्य करता है प्रोटीन (GAP) RhoA4के लिए सक्रिय .
जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते स्पष्ट करने के लिए खमीर suppressor स्क्रीन की उपयोगिता अतिरंजित नहीं किया जा सकता है, और अन्य शोधकर्ताओं intracellular जीवाणु प्रभावक प्रोटीन की विशेषता का प्रयास बहुत से लाभ हो सकता है इन तकनीकों. इन परख मूल्य के हैं अगर इम्यूनोप्रीसिएंस और / या खमीर दो संकर स्क्रीन एक बाध्यकारी साथी खोजने में विफल रहे हैं और स्पष्ट कर सकते हैं जो रास्ते जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित कर रहे हैं. यहाँ, विषाक्तता और suppressor स्क्रीन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल इंट्रासेलुलर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान जैविक रास्ते की पहचान करने के लिए प्रदान की जाती हैं, साथ ही आम बाधाओं में से कुछ का अनुभव जब इन परख और उनके इसी समाधान.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल एक संशोधित खमीर विषाक्तता और दमन स्क्रीन का उपयोग कर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान जैविक रास्ते की पहचान करने के लिए कदम दर कदम प्रक्रियाओं की रूपरेखा. खमीर तनाव का इस्तेम?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Shelby Andersen, एबी McCullough, और लॉरेल वुड्स इन तकनीकों के साथ उनकी सहायता के लिए धन्यवाद. इस अध्ययन के माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी के आयोवा विभाग से मैरी एम वेबर के लिए स्टार्टअप धन द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
References
- Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
- Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
- Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
- Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
- Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
- Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
- Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
- Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
- Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
- Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
- Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
- Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).
