使用酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白的宿主通路
Summary
细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以关键生物过程为目标。识别细菌效应蛋白所针对的宿主通路是解决分子发病机制的关键。这里，描述了一种使用改性酵母抑制剂和毒性筛分的方法，以阐明有毒细菌效应蛋白所针对的宿主通路。
Abstract
细胞内细菌将称为效应蛋白的毒性因子分泌到宿主细胞醇中，这些细胞醇的作用是破坏宿主蛋白和/或其相关的生物途径，以利于细菌。由于细菌基因组测序的进步和算法的出现，使得假定细菌效应蛋白的识别变得更加易于管理，这些算法允许在硅素识别编码分泌候选项和/或真核生物的基因方面进行编码域。然而，确定这些重要的毒力因素只是第一步。自然地，目标是确定效应蛋白的分子功能，并阐明它们如何与宿主相互作用。近年来，酵母双杂交筛和大规模免疫沉淀技术以及质谱仪等技术有助于识别蛋白质-蛋白质相互作用。虽然识别宿主结合性伴侣是阐明细菌效应蛋白的分子功能的关键的第一步，但有时宿主蛋白具有多种生物功能（例如，活性素、克拉辛、土布林），或细菌蛋白可能不会物理结合宿主蛋白，使研究人员失去有关纵的精确宿主通路的关键信息。经过修饰的酵母毒性筛与抑制器屏幕相结合，已调整，以识别受细菌效应蛋白影响的宿主通路。毒性屏幕依赖于由效应蛋白干扰宿主生物通路引起的酵母中的毒性效应，这通常表现为生长缺陷。酵母基因组库的表达用于识别抑制细菌效应蛋白毒性的宿主因子，从而识别效应蛋白靶向通路中的蛋白质。该协议包含毒性和抑制器屏幕的详细说明。这些技术可以在任何能够进行分子克隆和培养酵母和大肠杆菌的实验室中进行。
Introduction
第一次报告的程序类似于这里提出的那些特点军团菌肺炎嗜血杆菌类型IV效应器SidD，一个deAMPylase，修改Rab11。比较技术用于表征几个L.肺炎球菌效应器1，2，3。该测定被调整为Coxiella burnetii型IV效应蛋白4，最近该技术的效用被扩展为衣原体沙眼结合膜蛋白的表征5.
该协议可以分为两个主要部分：1）酵母毒性筛，其中感兴趣的细菌效应蛋白在酵母中表达，克隆被筛选为由生长缺陷证明的有毒表型，2）酵母抑制器屏幕，其中毒性表型被毒菌株中的酵母基因组库表达所抑制。因此，毒性屏幕是有毒表型的屏幕，当感兴趣的细菌效应者过度表达时，这些表型表现为生长缺陷。有毒克隆，成功地转换和表达细菌效应器，选择并保存下一步。第二个主要步骤涉及在有毒酵母克隆中过度表达部分消化的酵母基因组库。在该协议中建议使用酵母基因组库的质粒携带5-20 kb的插入物，通常对应于所有质粒平均基因大小为±1.5 kb的3~13个酵母开放阅读框架（ORF），代表覆盖的整个酵母基因组大约10倍。这部分的测定称为抑制器屏幕，因为目标是抑制细菌效应蛋白的毒性。电势抑制质粒从酵母中分离出来，测序，并识别抑制性ORF。抑制器屏幕的基本原理是，效应蛋白与其目标的宿主通路结合、相互作用和/或压倒其目标，而过量地将这些宿主蛋白提供回可挽救该通路的毒性效应，从而，生长缺陷。因此，抑制毒性的确定ORF通常代表宿主通路的多个参与者。然后进行正交实验，以验证细菌效应器确实与牵连通路相互作用。如果已识别出克扯林或肌蛋白等结合性伙伴，这一点尤为必要，因为这些蛋白质涉及多种宿主过程。进一步的实验可以阐明感染过程中效应蛋白的生理功能。毒性和抑制器屏幕也是破译细菌效应蛋白的生理功能的有力工具，这些蛋白质在物理上不会将宿主蛋白与亲和力结合，其亲和力足以通过免疫沉淀检测或与在酶命中和运行交互中主机，这些交互可能不会被酵母-二混合屏幕检测到。
虽然抑制器屏幕可以是一种强大的方法来揭示细菌效应蛋白和宿主通路之间的潜在生理相互作用，但细菌效应蛋白必须诱导酵母中的生长缺陷，否则在抑制器屏幕将没有什么用。此外，有毒表型必须导致至少 2⁄3 log10增长赤字，否则将难以识别抑制器。如果为细胞培养建立实验室，在HeLa等常见细胞系中筛选毒性效应蛋白通常可以洞察是否值得进行酵母毒性筛查。HeLa细胞中效应蛋白的异位表达有时导致毒性，与用于这些屏幕4的酵母菌株的毒性密切相关。HeLa细胞中可观察到的应力特征包括应力纤维的丧失、细胞脱离板和指示凋亡的核凝结。HeLa细胞中任何压力的视觉指示都使得感兴趣的蛋白质成为诱导酵母生长缺陷的良好候选者，酵母的复制速度要快得多，从而对基本通路的扰动反应更灵敏。
应当指出，抑制器屏幕并不总是将宿主绑定伙伴标识为抑制器，但它仍然可能涉及目标宿主通路的关键组件，从而全面了解被细菌效应蛋白。从表面上看，这似乎是违反直觉的，因为提供过量的效应蛋白的结合伙伴有望挽救生长缺陷。在努力确定C.沙眼效应蛋白CT229（CpoS）所针对的途径时，在感染5期间与至少10种不同的Rab GTPass结合，没有一个拉布结合伙伴抑制了CT229的毒性。然而，查明了参与克拉林涂层囊泡（CCV）贩运的许多抑制者，这导致进一步的工作表明，CT229特别颠覆了依赖Rab的CCV贩运。同样，在调查C.burnetii效应蛋白Cbu0041（CirA）时，发现了几种能挽救酵母生长缺陷的Rho GTPases，后来发现CirA作为RhoA4的GTPase激活蛋白（GAP）的作用。
酵母抑制器屏幕对阐明细菌效应蛋白靶向宿主通路的效用怎么强调也不过分，其他试图描述细胞内细菌效应蛋白的研究人员可以从中获益这些技术。如果免疫沉淀和/或酵母-两个混合屏幕未能找到结合的伙伴，并且可以阐明细菌效应蛋白所针对的通路，这些检测是有价值的。在这里，提供了毒性和抑制器屏幕的详细方案，以识别细胞内细菌效应蛋白所针对的宿主生物通路，以及使用这些测定剂及其相应的解决方案。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议概述了使用改性酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白靶向宿主生物通路的分步程序。使用的酵母菌株，S.cerevisiae W303，是辅助营养的尿素和亮氨酸。该菌株的Uracil辅助营养器用于选择含有pYesNTA-Kan载体上感兴趣的蛋白质的酵母，而亮氨酸辅助营养器用于选择酵母基因组库载体pYep13。酵母基因组库质粒携带3~13个ORF，因此每个ORF应单独克隆到p415-ADH载体6或类似载体?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢谢尔比·安德森、艾比·麦卡洛和劳雷尔·伍兹在这些技术方面给予的帮助。这项研究由爱荷华大学微生物学和免疫学系的启动基金资助给玛丽M.韦伯。
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
References
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