Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen
Summary
Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.
Abstract
Intracellulaire bacteriën scheiden virulentie factoren die Effector eiwitten worden genoemd in de gastheer cytosol die handelen om gastheer eiwitten en/of hun geassocieerde biologische trajecten te verdraaien ten voordele van de bacterie. Identificatie van vermoedelijke bacteriële Effector eiwitten is meer beheersbaar geworden als gevolg van vooruitgang in bacteriële genoom volgordebepaling en de opkomst van algoritmen die toelaten in silico identificatie van genen coderen van secretie kandidaten en/of eukaryotic-achtige Domeinen. De identificatie van deze belangrijke virulentie factoren is echter slechts een eerste stap. Het doel is natuurlijk om de moleculaire functie van Effector eiwitten te bepalen en te verhelderen hoe ze omgaan met de gastheer. In de afgelopen jaren hebben technieken zoals het gist-twee-hybride scherm en grootschalige immunoprecipitaties in combinatie met massaspectrometrie geholpen bij de identificatie van eiwit-eiwit interacties. Hoewel identificatie van een host binding partner de cruciale eerste stap is om de moleculaire functie van een bacterieel Effector eiwit te verhelderend, wordt soms vastgesteld dat het gastheer eiwit meerdere biologische functies heeft (bijv. actin, clathrin, tubuline) of het bacteriële eiwit kan niet fysiek binden gastheer eiwitten, het ontnemen van de onderzoeker van cruciale informatie over de precieze gastheer traject wordt gemanipuleerd. Een gemodificeerd gist toxiciteits scherm in combinatie met een suppressor scherm is aangepast om gastheer trajecten te identificeren die worden beïnvloed door bacteriële Effector eiwitten. Het toxiciteits scherm is afhankelijk van een toxisch effect in gist veroorzaakt door de Effector proteïne interfereren met de gastheer biologische trajecten, die vaak manifesteert als een groei fout. De uitdrukking van een gist genomische bibliotheek wordt gebruikt om gastheerfactoren te identificeren die de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit onderdrukken en zo eiwitten identificeren in het traject dat het Effector eiwit target. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor zowel de toxiciteits-als de suppressor-schermen. Deze technieken kunnen worden uitgevoerd in elk lab dat geschikt is voor moleculair klonen en teelt van gist en Escherichia coli.
Introduction
Het eerste rapport van procedures vergelijkbaar met die hier gepresenteerd gekenmerkt de Legionella pneumophila type IV Effector Sidd, een deAMPylase dat wijzigt Rab11. Er werden vergelijkbare technieken gebruikt voor de karakterisering van verschillende L. pneumophila Effectors1,2,3. De assay werd aangepast om een Coxiella burnetii type IV Effector proteïne4te karakteriseren, en onlangs werd het nut van deze techniek uitgebreid voor de karakterisering van Chlamydia trachomatis inclusie membraan eiwitten5 .
Dit protocol kan worden opgesplitst in twee belangrijke delen: 1) het gist toxiciteits scherm, waarin de bacteriële Effector proteïne van belangstelling wordt uitgedrukt in gist en klonen worden gescreend op een toxisch fenotype zoals blijkt uit een groei fout, en 2) het gist suppressor-scherm , waarin het toxische fenotype wordt onderdrukt door uitdrukking van een gist genomische bibliotheek in de toxische stam. Zo is het toxiciteits scherm een scherm voor toxische fenotypes dat zich manifesteert als groei fouten wanneer de bacteriële Effector van belang wordt overexpressie. Giftige klonen, succesvol getransformeerd met en uitdrukken van de bacteriële Effector, worden geselecteerd en opgeslagen voor de volgende stap. De tweede belangrijke stap is het overdrukken van een gedeeltelijk verteerde gist genomische bibliotheek in de giftige gist kloon. Plasmiden maken van de gist genomische Library voorgesteld voor het gebruik in dit protocol dragen 5 − 20 KB inserts, meestal overeenkomend met 3 − 13 gist open reading frames (ORF) van een gemiddelde gengrootte van ~ 1,5 KB over alle plasmiden, die het hele gist genoom bedekt ongeveer 10x. Dit deel van de test wordt het suppressor scherm genoemd, omdat het doel is om de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit te onderdrukken. Potentiële suppressor plasmiden zijn geïsoleerd van gist, Sequenced, en het onderdrukken van Orf’s geïdentificeerd. De ratio die aan het onderdrukker scherm ten grondslag ligt, is dat de Effector proteïne bindt, samenwerkt met, en/of overweldt van componenten van het ontvangende pad dat het target, en dat het verstrekken van die gastheer eiwitten terug in overmaat het toxische effect op het traject kan redden en dus, de groei fout. Zo, geïdentificeerde Orf’s die toxiciteit onderdrukken vaak vertegenwoordigen meerdere deelnemers van een host-traject. Orthogonale experimenten worden vervolgens uitgevoerd om te controleren of de bacteriële Effector inderdaad met het betrokken traject samenwerkt. Dit is vooral nodig als een bindende partner zoals clathrin of actine is geïdentificeerd, omdat deze eiwitten betrokken zijn bij een veelheid van hostprocessen. Verdere experimenten kunnen dan de fysiologische functie van het Effector eiwit verheldoen tijdens infectie. De toxiciteits-en suppressor schermen zijn ook krachtige hulpmiddelen voor het ontcijferen van de fysiologische functie van bacteriële Effector eiwitten die niet fysiek gastheer eiwitten binden met affiniteiten die voldoende zijn om te detecteren door immunoprecipitatie of die interageren met de host in enzymatische hit-and-run interacties die mogelijk niet worden gedetecteerd door een gist-twee hybride scherm.
Hoewel het suppressor-scherm een krachtige methode kan zijn om potentiële fysiologische interacties tussen bacteriële Effector eiwitten en hosttrajecten te onthullen, moet het bacteriële Effector eiwit een groei fout in gist induceren, anders gebruikt het in de het onderdrukker scherm zal weinig gebruikt worden. Bovendien moet het toxische fenotype resulteren in ten minste een 2 − 3 log10 -tekort in groei of het zal moeilijk zijn om suppressors te identificeren. Als een laboratorium is opgezet voor celkweek, screening Effector eiwitten voor toxiciteit in gemeenschappelijke cellijnen zoals HeLa kan vaak inzicht geven of het de moeite waard om door te gaan met de gist toxiciteit scherm. Ectopische uitdrukking van het Effector-eiwit in HeLa-cellen leidt soms tot toxiciteit die zeer sterk correleert met de toxiciteit in de gist stam die voor deze schermen wordt gebruikt4. Waarneembare kenmerken van stress in HeLa-cellen zijn verlies van stress vezels, celloslating van de plaat en nucleaire condensatie die apoptosis aangeeft. Elke visuele indicatie van stress in HeLa-cellen maakt het eiwit van belang een goede kandidaat voor het induceren van een groei fout in gist, die veel sneller repliceert en dus beter reageert op perturbatie van essentiële trajecten.
Opgemerkt moet worden dat het onderdrukker scherm niet altijd host binding partners identificeert als onderdrukkers, maar het kan nog steeds cruciale componenten van de beoogde host-traject (en) impliceren, wat een holistisch beeld oplevert van de biologische processen die worden gekaapt door de bacteriële Effector eiwitten. Op het oppervlak, dit lijkt contra-intuïtief, omdat het verstrekken van de bindende partner van de Effector eiwit in overmaat zou worden verwacht dat de groei defect te redden. Bij inspanningen om trajecten te identificeren die zijn getarget door de C. trachomatis Effector Protein CT229 (cpos), die bindt aan ten minste 10 verschillende Rab GTPases tijdens infectie5, onderdrukte geen van de bindende partners van Rab de toxiciteit van CT229. Er werden echter talrijke onderdrukkers geïdentificeerd die betrokken waren bij de handel met clathrin-Coated blaasje (CCV), wat leidde tot verder werk dat aantoont dat CT229 in het bijzonder Rab-afhankelijke CCV-mensenhandel ondermijnt. Evenzo, bij het onderzoeken van de C. burnetii Effector Protein Cbu0041 (CIRA) verschillende Rho gtpases die de gist groei defect gered werden geïdentificeerd, en het werd later gevonden dat CIRA fungeert als een GTPase activeren eiwit (Gap) voor rhoa4.
Het nut van de gist suppressor scherm voor verhelderende gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten kan niet worden overschat, en andere onderzoekers proberen te karakteriseren intracellulaire bacteriële Effector eiwitten kunnen sterk profiteren van deze technieken. Deze assays zijn van waarde als immunoprecipitaties en/of gist-twee hybride schermen hebben nagelaten een bindende partner te vinden en kunnen verheldoen welke trajecten zijn gericht op het bacteriële Effector eiwit. Hier, gedetailleerde protocollen voor de toxiciteit en suppressor schermen om gastheer biologische trajecten doelwit van intracellulaire bacteriële Effector eiwitten identificeren, evenals enkele van de gemeenschappelijke obstakels ervaren bij het gebruik van deze testen en hun bijbehorende oplossingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol schetst stapsgewijze procedures voor het identificeren van de gastheer biologische trajecten die zijn gericht door bacteriële Effector eiwitten met behulp van een gemodificeerde gist toxiciteit en suppressor scherm. De gebruikte gist stam, S. cerevisiae W303, is auxotrofische voor zowel uracil als leucine. Uracil auxotrophy van de stam wordt gebruikt om gist te selecteren die het eiwit van belangstelling draagt op de pYesNTA-kan vector, terwijl Leucine auxotrophy wordt gebruikt om te selecteren voo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Shelby Andersen, Abby McCullough en Laurel Woods voor hun hulp bij deze technieken. Deze studie werd gefinancierd door opstart fondsen van het departement van de Universiteit van Iowa van microbiologie en immunologie aan Mary M. Weber.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
References
- Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
- Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
- Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
- Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
- Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
- Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
- Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
- Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
- Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
- Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
- Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
- Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).
