Identifizierung von Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit Hefetoxizität und Suppressor-Screens gezielt werden
Summary
Bakterielle Krankheitserreger sezernieren Proteine in den Wirt, die auf entscheidende biologische Prozesse abzielen. Die Identifizierung der Wirtswege, auf die bakterielle Effektorproteine abzielen, ist der Schlüssel zur Bekämpfung der molekularen Pathogenese. Hier wird eine Methode beschrieben, bei der ein modifizierter Hefesuppressor und ein Toxizitäts-Bildschirm verwendet werden, um Wirtswege aufzuklären, die von toxischen bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden.
Abstract
Intrazelluläre Bakterien sezernieren Virulenzfaktoren, sogenannte Effektorproteine, in das Wirtszytosol, die wirtsproteine und/oder die damit verbundenen biologischen Bahnen zum Nutzen des Bakteriums untergraben. Die Identifizierung von vermeintlichen bakteriellen Effektorproteinen ist aufgrund der Fortschritte bei der Sequenzierung des bakteriellen Genoms und des Aufkommens von Algorithmen, die die Silico-Identifizierung von Genen ermöglichen, die Sekretionskandidaten und/oder eukaryotisch-ähnliche Domänen. Die Identifizierung dieser wichtigen Virulenzfaktoren ist jedoch nur ein erster Schritt. Natürlich ist das Ziel, die molekulare Funktion von Effektorproteinen zu bestimmen und zu klären, wie sie mit dem Wirt interagieren. In den letzten Jahren haben Techniken wie der Hefe-Zwei-Hybrid-Bildschirm und großflächige Immunpräzipitationen in Verbindung mit Massenspektrometrie bei der Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen unterstützt. Obwohl die Identifizierung eines Wirtsbindungspartners der entscheidende erste Schritt zur Aufklärung der molekularen Funktion eines bakteriellen Effektorproteins ist, hat das Wirtsprotein manchmal mehrere biologische Funktionen (z. B. Actin, Clathrin, Tubulin) oder Das bakterielle Protein kann Wirtsproteine nicht physisch binden, was dem Forscher wichtige Informationen über den genauen Wirtsweg, der manipuliert wird, vorenthält. Ein modifizierter Hefetoxizitätssieb in Verbindung mit einem Suppressor-Bildschirm wurde angepasst, um Wirtswege zu identifizieren, die von bakteriellen Effektorproteinen beeinflusst werden. Der Toxizitäts-Bildschirm beruht auf einer toxischen Wirkung in Hefe, die durch das Effektorprotein verursacht wird, das die biologischen Wirtswege stört, was sich oft als Wachstumsfehler manifestiert. Expression einer Hefegenombibliothek wird verwendet, um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die Toxizität des bakteriellen Effektorproteins unterdrücken, und so Proteine in dem Weg zu identifizieren, auf den das Effektorprotein abzielt. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen sowohl für die Toxizitäts- als auch für die Unterdrückerbildschirme. Diese Techniken können in jedem Labor durchgeführt werden, das in der Lage ist, molekulares Klonen und Kultivieren von Hefe und Escherichia coli.
Introduction
Der erste Bericht über Verfahren ähnlich denen, die hier vorgestellt wurden, charakterisierte die Legionella pneumophila Typ IV Effektor SidD, eine DeAMPylase, die Rab11ändert. Vergleichbare Techniken wurden für die Charakterisierung mehrerer L. pneumophila Effektoren1,2,3verwendet. Der Assay wurde angepasst, um ein Coxiella burnetii Typ IV Effektorprotein4zu charakterisieren, und vor kurzem wurde der Nutzen dieser Technik für die Charakterisierung von Chlamydia trachomatis Inklusionsmembranproteinen erweitert5 .
Dieses Protokoll kann in zwei Hauptteile unterteilt werden: 1) der Hefetoxizitätssieb, in dem das bakterielle Effektorprotein von Interesse in Hefe exprimiert wird und Klone auf einen toxischen Phänotyp untersucht werden, wie ein Wachstumsdefekt belegt ist, und 2) der Hefesuppressor-Bildschirm , bei dem der toxische Phänotyp durch Expression einer Hefe-Genombibliothek im toxischen Stamm unterdrückt wird. So ist der Toxizitätsbildschirm ein Bildschirm für toxische Phänotypen, die sich als Wachstumsdefekte manifestieren, wenn der bakterielle Effektor von Interesse überexprimiert wird. Toxische Klone, die erfolgreich mit dem bakteriellen Effektor transformiert und exemittiert werden, werden ausgewählt und für den nächsten Schritt gespeichert. Der zweite große Schritt besteht darin, eine teilweise verdaute Hefe-Genombibliothek im toxischen Hefeklon zu exexzessither zu exexzessiert. Plasmide, die die hefegenomische Bibliothek ausmachen, die für die Verwendung in diesem Protokoll vorgeschlagen wird, tragen 5-20 kb Einsätze, die in der Regel 3-13 Hefe-Open-Leserahmen (ORF) mit einer durchschnittlichen Gengröße von 1,5 kb über alle Plasmide entsprechen, die das gesamte abgedeckte Hefegenom darstellen. ca. 10x. Dieser Teil des Assays wird als Suppressor-Bildschirm bezeichnet, da das Ziel darin besteht, die Toxizität des bakteriellen Effektorproteins zu unterdrücken. Potenzielle Suppressorplasmide werden aus Hefe isoliert, sequenziert und die unterdrückenden ORFs identifiziert. Die dem Suppressor-Bildschirm zugrunde liegende Begründung ist, dass das Effektorprotein Komponenten des Wirtswegs bindet, mit ihm verbindet und/oder überwältigt, und dass die Bereitstellung dieser Wirtsproteine im Überschuss die toxische Wirkung auf den Pfad retten und somit, Wachstumsfehler. So stellen identifizierte ORFs, die Toxizität unterdrücken, oft mehrere Teilnehmer eines Wirtswegs dar. Orthogonale Experimente werden dann durchgeführt, um zu überprüfen, ob der bakterielle Effektor tatsächlich mit dem implizierten Weg interagiert. Dies ist insbesondere dann notwendig, wenn ein Bindungspartner wie Clathrin oder Actin identifiziert wurde, da diese Proteine an einer Vielzahl von Wirtsprozessen beteiligt sind. Weitere Experimente können dann die physiologische Funktion des Effektorproteins während der Infektion aufklären. Die Toxizitäts- und Unterdrückersiebe sind auch leistungsfähige Werkzeuge zur Entschlüsselung der physiologischen Funktion von bakteriellen Effektorproteinen, die Wirtsproteine nicht physisch mit Affinitäten binden, die ausreichen, um durch Immunpräzipitation zu erkennen, oder die mit dem in enzymatischen Hit-and-Run-Interaktionen, die möglicherweise nicht von einem Hefe-zwei-Hybrid-Bildschirm erkannt werden.
Obwohl der Suppressor-Bildschirm eine leistungsfähige Methode sein kann, um potenzielle physiologische Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Effektorproteinen und Wirtswegen aufzudecken, muss das bakterielle Effektorprotein einen Wachstumsfehler in Hefe induzieren, andernfalls Suppressor-Bildschirm wird wenig nutzen. Darüber hinaus muss der toxische Phänotyp zu mindestens einem Wachstumsdefizit von 2 bis 3 Log10 führen, oder es wird schwierig sein, Unterdrücker zu identifizieren. Wenn ein Labor für die Zellkultur eingerichtet ist, kann das Screening von Effektorproteinen auf Toxizität in gängigen Zelllinien wie HeLa oft einen Einblick geben, ob es sich lohnt, mit dem Hefetoxizitätsbildschirm fortzufahren. Die ektopische Expression des Effektorproteins in HeLa-Zellen führt manchmal zu toxizitätsbegierig, die sehr stark mit der Toxizität des Hefestamms korreliert, der für diese Bildschirme verwendet wird4. Beobachtbare Merkmale der Belastung in HeLa-Zellen sind der Verlust von Stressfasern, die Zellablösung von der Platte und die kerntechnische Kondensation, die auf Apoptose hindeutet. Jede visuelle Indikation von Stress in HeLa-Zellen macht das Protein von Interesse zu einem guten Kandidaten für die Induktion eines Wachstumsfehlers in Hefe, die sich viel schneller replizieren und somit besser auf Störungen wesentlicher Wege reagieren.
Es sollte beachtet werden, dass der Suppressor-Bildschirm nicht immer Host-Bindungspartner als Unterdrücker identifiziert, aber es kann immer noch kritische Komponenten des(n) Ziels des Wirtswegs mit einimplizieren, was zu einer ganzheitlichen Sicht auf die biologischen Prozesse führt, die von der bakterielles Effektorprotein. Oberflächlich betrachtet scheint dies kontraintuitiv, da die Bereitstellung des Bindungspartners des Effektorproteins im Überschuss den Wachstumsdefekt zu retten erwarten wäre. Bei den Bemühungen, die vom C. trachomatis Effector Protein CT229 (CpoS), das während derInfektionan mindestens 10 verschiedene Rab GTPases bindet, zu identifizieren, unterdrückte keiner der Rab-Bindenden die Toxizität von CT229. Es wurden jedoch zahlreiche Unterdrücker identifiziert, die am Handel mit Klathrin-beschichteten Vesikel (CCV) beteiligt waren, was zu weiteren Arbeiten führte, die belegen, dass CT229 den Von Rab abhängigen CCV-Handel gezielt untergräbt. In ähnlicher Weise wurden bei der Untersuchung des C. burnetii Effektorproteins Cbu0041 (CirA) mehrere Rho GTPases identifiziert, die den Hefewachstumsdefekt retteten, und es wurde später festgestellt, dass CirA als GTPase-aktivierendes Protein (GAP) für RhoA4fungiert.
Die Nützlichkeit des Hefesuppressor-Bildschirms zur Aufklärung von Wirtswegen, die von bakteriellen Effektorproteinen ins Visier genommen werden, kann nicht überbewertet werden, und andere Forscher, die versuchen, intrazelluläre bakterielle Effektorproteine zu charakterisieren, können diese Techniken. Diese Assays sind von Wert, wenn Immunpräzipitiermitteln und/oder Hefe-zwei Hybrid-Screens keinen Bindungspartner gefunden haben und klären können, welche Wege durch das bakterielle Effektorprotein ins Visier genommen werden. Hier werden detaillierte Protokolle für die Toxizitäts- und Unterdrücker-Screens zur Identifizierung von wirtlichen biologischen Pfaden bereitgestellt, die von intrazellulären bakteriellen Effektorproteinen ins Visier genommen werden, sowie einige der häufigsten Hindernisse, die bei der Verwendung dieser Assays und ihrer entsprechenden Lösungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt schritt-für-Schritt-Verfahren zur Identifizierung von biologischen Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit einer modifizierten Hefetoxizität und einem Suppressor-Bildschirm ins Visier genommen werden. Der verwendete Hefestamm, S. cerevisiae W303, ist auxotroph für Uracil und Leucin. Uracil-Auxotrophie des Stammes wird verwendet, um Hefe auszuwählen, die das Protein von Interesse auf dem pYesNTA-Kan Vektor trägt, während Leucin-Auxotrophie verwendet wird, um für …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Shelby Andersen, Abby McCullough und Laurel Woods für ihre Unterstützung bei diesen Techniken. Diese Studie wurde durch Start-up-Fonds der University of Iowa Department of Microbiology and Immunology an Mary M. Weber finanziert.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
References
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