Identifisering av Host trasé målrettet av bakteriell effektor proteiner bruker gjær toksisitet og Suppressor screens
Summary
Bakterielle patogener skiller proteiner inn i verten som mål avgjørende biologiske prosesser. Identifisering av verts banene som er målrettet mot bakterielle effektor proteiner, er nøkkelen til å ta opp molekylær patogenesen. Her er en metode som bruker en modifisert gjær Suppressor og toksisitet skjermen for å belyse vert trasé målrettet av giftige bakteriell effektor proteiner er beskrevet.
Abstract
Intracellulære bakterier skiller ut virulens faktorer kalt effektor proteiner inn i verten stoffer som handler for å undergrave vert proteiner og/eller deres tilknyttede biologiske trasé til fordel for bakterien. Identifisering av antatte bakteriell effektor proteiner har blitt mer håndterlig på grunn av fremskritt i bakterielle Genova sekvensering og advent av algoritmer som tillater i silisiummangan identifisering av gener koding sekresjon kandidater og/eller eukaryote-lignende Domener. Identifisering av disse viktige virulens faktorene er imidlertid bare et første skritt. Målet er naturligvis å bestemme molekyl funksjonen til effektor proteiner og belyse hvordan de samhandler med verten. I de senere årene, teknikker som gjær to-hybrid skjerm og stor skala immunoprecipitations kombinert med masse massespektrometri har hjulpet i identifisering av protein-protein interaksjoner. Selv om identifisering av en verts bindende partner er det avgjørende første skrittet mot å Elucidating molekyl funksjonen til et bakteriell effektor protein, finnes det noen ganger verts proteinet som har flere biologiske funksjoner (f.eks. utgangen, clathrin, tubulin) eller bakteriell protein kan ikke fysisk binde vert proteiner, frata forskeren av avgjørende informasjon om den presise verten stien blir manipulert. En modifisert gjær toksisitet skjermen kombinert med en Suppressor skjermen har blitt tilpasset for å identifisere verten trasé påvirket av bakteriell effektor proteiner. Toksisitet skjermen er avhengig av en giftig effekt i gjær forårsaket av effektor protein forstyrrer verten biologiske trasé, som ofte manifesterer som en vekst defekt. Uttrykk for en gjær genomisk biblioteket brukes til å identifisere verten faktorer som undertrykker toksisitet av bakteriell effektor protein og dermed identifisere proteiner i veien at effektor protein mål. Denne protokollen inneholder detaljerte instruksjoner for både toksisitet og Suppressor skjermene. Disse teknikkene kan utføres i enhver Lab i stand til molekylær kloning og dyrking av gjær og Escherichia coli.
Introduction
Den første rapporten av prosedyrer som ligner på de som presenteres her preget Legionella pneumophila type IV effektor SidD, en deAMPylase som modifiserer Rab11. Sammenlignbare teknikker ble brukt for karakterisering av flere L. pneumophila effekt Orer1,2,3. Analysen ble tilpasset for å karakterisere en Coxiella coxiella type IV effektor protein4, og nylig nytten av denne teknikken ble utvidet for karakterisering av Chlamydia trachomatis inkludering membran proteiner5 .
Denne protokollen kan deles inn i to store deler: 1) gjær toksisitet skjermen, der bakteriell effektor protein av interesse er uttrykt i gjær og kloner er vist for en giftig fenotype som dokumentert av en vekst defekt, og 2) gjær Suppressor skjermen , der giftig fenotype er undertrykt av uttrykk for en gjær genomisk bibliotek i giftig belastning. Dermed er toksisitet skjermen en skjerm for giftig fenotyper som manifesterer som vekst defekter når bakteriell effektor av interesse er overexpressed. Giftig kloner, hell forvandlet med og uttrykker bakteriell effektor, er valgt og lagret for neste trinn. Den andre store skritt innebærer overexpressing en delvis fordøyd gjær genomisk biblioteket i giftig gjær klone. Plasmider gjør opp gjær genomisk biblioteket foreslått for bruk i denne protokollen bære 5 − 20 KB inserts, vanligvis tilsvarende 3 − 13 gjær åpne lese RAM mer (ORF) av en gjennomsnittlig gen størrelse på ~ 1,5 kb tvers av alle plasmider, som representerer hele gjær Genova dekket omtrent 10x. Denne delen av analysen kalles Suppressor skjermen, som målet er å undertrykke toksisitet av bakteriell effektor protein. Potensielle Suppressor plasmider er isolert fra gjær, sekvensert, og den undertrykke ORFs identifisert. Begrunnelsen underliggende Suppressor skjermen er at effektor protein binder, samhandler med, og/eller overvelder komponenter av verten veien den mål, og som gir de vert proteiner tilbake i overkant kan redde den giftige effekten på veien og dermed, vekst mangelen. Dermed identifiserte ORFs som undertrykker toksisitet ofte representerer flere deltakere på en vert sti. Ortogonale eksperimenter blir deretter utført for å verifisere at bakteriell effektor faktisk samhandler med de impliserte veien. Dette er spesielt nødvendig hvis en bindende partner som clathrin eller utgangen er identifisert, fordi disse proteinene er involvert i en rekke verts prosesser. Ytterligere eksperimenter kan deretter belyse den fysiologiske funksjonen til det effektor proteinet under infeksjonen. Den toksisitet og Suppressor skjermene er også kraftige verktøy for å tyde den fysiologiske funksjon av bakterielle effektor proteiner som ikke fysisk binder verten proteiner med slektskap tilstrekkelig til å oppdage ved immunutfelling eller som samhandler med vert i enzymatisk hit-and-Run interaksjoner som ikke kan oppdages av en gjær-to hybrid skjerm.
Selv om Suppressor skjermen kan være en kraftig metode for å avdekke potensielle fysiologiske interaksjoner mellom bakteriell effektor proteiner og vert trasé, bakteriell effektor protein må indusere en vekst defekt i gjær, ellers bruker det i Suppressor skjermen vil være til liten nytte. Videre må den giftige fenotype resultere i minst en 2 − 3 log10 underskudd i vekst eller det vil være vanskelig å identifisere Suppressors. Hvis et laboratorium er satt opp for cellekultur, screening effektor proteiner for toksisitet i vanlige cellelinjer som HeLa kan ofte gi innsikt om hvorvidt det er verdt innsatsen for å fortsette med gjær toksisitet skjermen. Utenfor livmoren uttrykk for effektor protein i HeLa celler noen ganger resulterer i toksisitet som samsvarer veldig sterkt med toksisitet i gjær belastningen brukes for disse skjermene4. Observer kjennetegn ved stress i HeLa celler inkluderer tap av stress fibre, celle avløsning fra platen, og kjernefysisk kondens indikerer apoptose. Enhver visuell indikasjon på stress i jakten celler gjør protein av interesse en god kandidat for inducing en vekst defekt i gjær, som replikere mye raskere og er dermed mer mottakelig for forstyrrelsene av essensielle trasé.
Det bør bemerkes at Suppressor skjermen ikke alltid identifisere vert bindende partnere som Suppressors, men det kan fortsatt implisere kritiske komponenter av verten Pathway (s) målrettede, gir et helhetlig syn på de biologiske prosessene blir kapret av bakteriell effektor protein. På overflaten synes dette counterintuitive, fordi gir bindende partner av effektor protein i overkant ville forventes å redde vekst defekt. I arbeidet med å identifisere trasé målrettet av C. trachomatis EFFEKTOR protein CT229 (CpoS), som binder seg til minst 10 forskjellige Rab GTPases under infeksjon5, ingen av Rab bindende partnere undertrykt toksisitet av CT229. Imidlertid ble tallrike Suppressors involvert i clathrin-belagt vesicle (CCV) identifisert, noe som førte til ytterligere arbeid med å demonstrere at CT229 spesifikt subverts Rab-avhengige CCV smugling. Tilsvarende når gransker C. coxiella effektor protein Cbu0041 (CirA) flere Rho GTPases som reddet gjær vekst defekt ble identifisert, og det ble senere funnet at CirA fungerer som en GTPase aktivere PROTEIN (gap) for RhoA4.
Nytten av gjær Suppressor skjermen for Elucidating vert trasé rettet mot bakteriell effektor proteiner kan ikke være overdrevet, og andre forskere forsøker å karakterisere intracellulære bakteriell effektor proteiner kan i stor grad ha nytte av disse teknikkene. Disse analysene er av verdi hvis immunoprecipitations og/eller gjær-to hybrid skjermer har unnlatt å finne en bindende partner og kan belyse hvilke trasé er målrettet av bakteriell effektor protein. Her, detaljerte protokoller for toksisitet og Suppressor skjermer for å identifisere vert biologiske trasé målrettet av intracellulære bakteriell effektor proteiner er gitt, samt noen av de vanlige hindringene oppleves når du bruker disse analysene og deres tilhørende løsninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen skisserer trinn-for-trinn prosedyrer for å identifisere vert biologiske trasé målrettet av bakteriell effektor proteiner ved hjelp av en modifisert gjær toksisitet og Suppressor skjermen. Gjær belastningen brukes, S. cerevisiae W303, er auxotrophic for både uracil og leucine. Uracil auxotrophy av belastningen brukes til å velge gjær bærer protein av interesse på pYesNTA-kan vektor mens leucine auxotrophy brukes til å velge for gjær genomisk biblioteket vektor pYep13. Den gjær genom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Shelby Andersen, Abby McCullough og Laurel Woods for deres hjelp med disse teknikkene. Denne studien ble finansiert ved oppstart midler fra University of Iowa Institutt for mikrobiologi og immunologi til Mary M. Weber.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
References
- Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
- Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
- Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
- Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
- Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
- Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
- Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
- Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
- Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
- Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
- Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
- Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).
