Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi
Summary
Bakteriyel patojenler, önemli biyolojik süreçleri hedef alan konakiçine protein salgılarlar. Bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarının belirlenmesi moleküler patogenezi ele almanın anahtarıdır. Burada, toksik bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarını açıklamak için modifiye edilmiş maya bastırıcı ve toksisite ekranı kullanılarak kullanılan bir yöntem tanımlanmıştır.
Abstract
Hücre içi bakteriler, konak proteinleri ve/veya bunların ilişkili biyolojik yollarını bakterinin yararına bozmak için harekete giren konak sitosola efektör proteinler adı verilen virülans faktörleri salgılarlar. Putatif bakteriyel efektör proteinlerinin tanımlanması, bakteri genom dizilimindeki gelişmeler ve salgı adaylarını ve/veya ökaryotik benzeri genlerin silico olarak tanımlanmasına olanak sağlayan algoritmaların ortaya çıkması yla daha yönetilebilir hale gelmiştir. Etki alanları. Ancak, bu önemli virülans faktörlerinin belirlenmesi sadece bir başlangıç adımıdır. Doğal olarak, amaç efektör proteinlerin moleküler fonksiyonunu belirlemek ve konak ile nasıl etkileşime açıklanır. Son yıllarda, maya iki melez ekran ve kütle spektrometresi ile birleştiğinde büyük ölçekli immünopretri gibi teknikler protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesinde yardımcı olması. Bir konak bağlayıcı ortağın tanımlanması, bakteriyel efektör proteinin moleküler işlevini niçin açıklığa kavuşturmaya yönelik önemli bir ilk adım olsa da, bazen konak proteinin birden fazla biyolojik işlevi olduğu saptandı (örneğin, aktin, klathrin, tubulin), veya bakteriyel protein, konak proteinlerini fiziksel olarak bağlamayabilir, bu da araştırmacıyı manipüle edilen kesin konak yolu hakkında önemli bilgilerden mahrum bırakabilir. Bir bastırıcı ekran ile birleştiğinde modifiye maya toksisite ekranı bakteriyel efektör proteinler tarafından etkilenen konak yollarını belirlemek için adapte edilmiştir. Toksisite ekranı, genellikle büyüme kusuru olarak kendini gösteren konak biyolojik yolları etkileyen efektör proteinin neden olduğu mayadaki toksik etkiye dayanır. Bir maya genomik kütüphane ifadesi bakteriyel efektör proteintoksisitesini bastırmak ve böylece etkici protein hedefleri yolunda proteinleri belirlemek konak faktörleri tanımlamak için kullanılır. Bu protokol hem toksisite hem de bastırıcı ekranlar için ayrıntılı talimatlar içerir. Bu teknikler moleküler klonlama ve maya ve Escherichia coliekimi yeteneğine sahip herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.
Introduction
Burada sunulan benzer prosedürlerin ilk raporu Legionella pnömofili tip IV efektör SidD karakterize,Rab11 değiştirir bir deAMPylase . Karşılaştırılabilir teknikler birkaç L. pnömofili efektörlerinin karakterizasyonu için kullanılmıştır1,2,3. Bir Coxiella burnetii tip IV efektör proteinkarakterizeetmek için yapılan tetkik, ve son zamanlarda bu tekniğin yararı Klamidya trachomatis inklüzum membran proteinlerin karakterizasyonu için genişletildi5 .
Bu protokol iki ana bölüme ayrılabilir: 1) hangi ilgi bakteriyel efektör protein ifade edilir maya toksisite ekranı ve klonlar bir büyüme defekti ile kanıtlandığı gibi toksik bir fenotip için taranır, ve 2) maya bastırıcı ekran , hangi toksik fenotip toksik suşu bir maya genomik kütüphane ifadesi ile bastırılır. Böylece, toksisite ekranı ilgi bakteriyel etkisi aşırı ifade edildiğinde büyüme kusurları olarak tezahür toksik fenotipler için bir ekrandır. Toksik klonlar, başarıyla dönüştürülmüş ve bakteriyel efektör ifade, seçilir ve bir sonraki adım için kaydedilir. İkinci büyük adım toksik maya klon kısmen sindirilmiş maya genomik kütüphane overexpressing içerir. Bu protokolde kullanılmak üzere önerilen maya genomik kütüphanesini oluşturan plazmidler, genellikle tüm plazmidlerde ~1,5 kb ortalama gen boyutuna karşılık gelen ve tüm maya genomunu kaplayan 5−20 kb ek uçlar taşırlar. yaklaşık 10x. Amaç bakteriyel efektör proteinin toksisitesini bastırmak için olduğu gibi, testin bu bölümü, bastırıcı ekran denir. Potansiyel bastırıcı plazmidler mayadan izole edilir, dizilir ve baskılayıcı ORF’ler tanımlanır. Bastırıcı ekranın altında yatan mantık, efektör proteinin hedefaldığı ana yol bileşenlerini bağlaması, etkileşimi ve/veya bunaltmasi ve bu konak proteinlerinin aşırı olarak geri sağlanmasının yol üzerindeki toksik etkiyi kurtarabileceği ve böylece, büyüme kusuru. Böylece, toksisiteyi baskılayan tanımlanmış ORF’ler genellikle bir ana yolun birden fazla katılımcıyı temsil eder. Ortogonal deneyler daha sonra bakteriyel efektör gerçekten karıştığı yol ile etkileşime doğrudoğrulamak için yapılır. Bu proteinler çok sayıda konak sürecine dahil olduğundan, clathrin veya aktin gibi bağlayıcı bir ortak tespit edildiyse bu özellikle gereklidir. Daha sonra daha fazla deney enfeksiyon sırasında efektör proteinfizyolojik işlevini açıklayabilir. Toksisite ve bastırıcı ekranlar aynı zamanda, konak proteinlerini immünoprepitasyon la tespit etmeye yetecek yakınlıklarla fiziksel olarak bağlamayan veya bir maya-iki hibrid ekran tarafından tespit olmayabilir enzimatik vur-çalıştır etkileşimleri ev sahibi.
Bastırıcı ekran bakteriyel efektör proteinler ve konak yolları arasındaki potansiyel fizyolojik etkileşimleri ortaya çıkarmak için güçlü bir yöntem olsa da, bakteriyel efektör protein maya bir büyüme defekti neden olmalıdır, aksi takdirde kullanarak bastırıcı ekran çok az kullanım olacaktır. Ayrıca, toksik fenotip büyüme en az 2−3 log10 açığı neden olmalıdır ya da bastırıcılar belirlemek zor olacaktır. Bir laboratuvar hücre kültürü için kurulmuşsa, HeLa gibi ortak hücre hatlarında toksisite için tarama efektörü proteinler genellikle maya toksisite ekran ile devam etmek için çaba değer olup olmadığı konusunda fikir verebilir. HeLa hücrelerinde efektör proteinin ektopik ekspresyonu bazen bu ekranlar için kullanılan maya suşundaki toksisite ile çok güçlü bir şekilde ilişkili toksisite ile sonuçlanır4. HeLa hücrelerinde stres gözlemlenebilir özellikleri stres liflerinin kaybı dahil, plaka hücre ayrılması, ve apoptosis gösteren nükleer yoğuşma. HeLa hücrelerinde stres herhangi bir görsel göstergesi ilgi protein maya bir büyüme defekti indüklemek için iyi bir aday yapmak, hangi çok daha hızlı çoğaltmak ve böylece daha gerekli yolların tedirginlik duyarlı.
Bu bastırıcı ekran her zaman bastırıcı olarak konak bağlayıcı ortakları tanımlamak değil unutulmamalıdır, ama yine de hedeflenen konak yolu (lar) kritik bileşenleri ima edebilir, biyolojik süreçlerin bütünsel bir görünüm elde bakteriyel efektör protein. Yüzeyde, bu mantıksız görünüyor, çünkü aşırı efektör protein bağlayıcı ortağı sağlayan büyüme defekti kurtarmak için beklenebilir. C. trachomatis efektör protein CT229 (CpoS) tarafından hedeflenen yolları belirlemek için çabalar, hangi enfeksiyon sırasında en az 10 farklı Rab GTPases bağlanır5, Rab bağlayıcı ortakların hiçbiri CT229 toksisitesini bastırılmış. Ancak, clathrin kaplı vezikül (CCV) ticaretinde yer alan çok sayıda bastırıcı tespit edilmiştir ve bu da CT229’un özellikle Rab bağımlı CCV ticaretini bozan çalışmalara yol açmıştır. Benzer şekilde, C. burnetii efektör protein Cbu0041 (CirA) maya büyüme defekti kurtarıldı birkaç Rho GTPases araştırırken tespit edildi, ve daha sonra RhoA için bir GTPase aktive protein (GAP) olarak CirA fonksiyonları bulundu4.
Bakteriyel efektör proteinler tarafından hedeflenen konak yollarının aydınlatılması için maya bastırıcı ekranın yararlılığı abartılamaz ve hücre içi bakteriyel efektör proteinlerini karakterize etmeye çalışan diğer araştırmacılar bundan büyük ölçüde fayda sağlayabilirler. bu teknikler. İmmünenyağışlar ve/veya maya-iki hibrid ekranlar bağlayıcı bir ortak bulamamışsa ve hangi yolların bakteriyel efektör protein tarafından hedeflendiğini açıklayabilirse bu tahliller değerlidir. Burada, hücre içi bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak biyolojik yollarını belirlemek için toksisite ve bastırıcı ekranlar için ayrıntılı protokoller, ayrıca bu tahliller ve bunların kullanımında karşılaşılan ortak engellerden bazıları sağlanır. ilgili çözümler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, modifiye edilmiş maya toksisitesi ve bastırıcı ekran kullanarak bakteriyel efektör proteinler tarafından hedeflenen konak biyolojik yollarını belirlemek için adım adım prosedürleri özetliyor. Kullanılan maya suşu, S. cerevisiae W303, hem urasil hem de lösin için yardımcı dır. Suş urasil auxotrophy pYesNTA-Kan vektörü üzerinde ilgi protein taşıyan maya seçmek için kullanılır ise lösin ekofofimaya genomik kütüphane vektör pYep13 seçmek için kullanılır. Maya genomi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Shelby Andersen, Abby McCullough ve Laurel Woods’a bu tekniklerle ilgili yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Iowa Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü’nden Mary M. Weber’e başlangıç fonları tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
References
- Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
- Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
- Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
- Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
- Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
- Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
- Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
- Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
- Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
- Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
- Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
- Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).
