Identifikation af værts veje, som er målrettet mod bakterielle Effector-proteiner ved hjælp af gær toksicitet og suppressor skærme

Summary

Bakterielle patogener udskiller proteiner i værten, der er målrettet mod afgørende biologiske processer. Identificering af værts vejene, der er målrettet mod bakterielle Effector proteiner, er nøglen til at tackle Molekylær patogenese. Her beskrives en metode ved hjælp af en modificeret gær suppressor og toksicitet skærm til at belyse vært veje, der er målrettet af giftige bakterielle Effector proteiner.

Abstract

Intracellulære bakterier udskiller virulensfaktorer kaldet Effector proteiner i værten cytosol, der virker til at undergrave Host proteiner og/eller deres tilknyttede biologiske veje til gavn for bakterien. Identifikation af formodede bakterielle Effector proteiner er blevet mere håndterbare på grund af fremskridt i bakteriel genom sekvensering og fremkomsten af algoritmer, der tillader i silico identifikation af gener kodning sekretion kandidater og/eller eukaryotic-lignende Domæner. Identifikationen af disse vigtige virulensfaktorer er dog kun et første skridt. Naturligvis er målet at bestemme den molekylære funktion af Effector proteiner og belyse, hvordan de interagerer med værten. I de seneste år, teknikker som gær to-hybrid skærm og storstilet immunopræcipitationer kombineret med massespektrometri har hjulpet i identifikationen af protein-protein interaktioner. Selv om identifikation af en værts bindende partner er det afgørende første skridt i retning af at belyse den molekylære funktion af et bakterielt Effector-protein, er værts proteinet sommetider fundet at have flere biologiske funktioner (f. eks. actin, clathrin, Tubulin) eller det bakterielle protein kan ikke fysisk binde Host proteiner, fratage forskeren af afgørende oplysninger om den præcise vært pathway bliver manipuleret. En modificeret gær toksicitet skærm kombineret med en suppressor skærm er blevet tilpasset til at identificere vært veje påvirket af bakterielle Effector proteiner. Toksicitets skærmen er afhængig af en toksisk virkning i gær forårsaget af Effector protein, der forstyrrer værts biologiske veje, som ofte manifesterer sig som en vækst defekt. Udtryk for en gær genomisk bibliotek bruges til at identificere vært faktorer, der undertrykker toksiciteten af bakterien Effector protein og dermed identificere proteiner i den vej, Effector protein mål. Denne protokol indeholder detaljerede anvisninger for både toksicitet og suppressor skærme. Disse teknikker kan udføres i ethvert laboratorium, der er i stand til molekylær kloning og dyrkning af gær og Escherichia coli.

Introduction

Den første rapport af procedurer svarende til dem, der præsenteres her karakteriseret Legionella pneumophila type IV Effector sidd, en deAMPylase, der ændrer Rab1¹. Sammenlignelige teknikker blev anvendt til karakterisering af flere L. pneumophila efftorer^1,2,3. Analysen blev tilpasset til at karakterisere en Coxiella burnetii type IV Effector protein⁴, og for nylig nytten af denne teknik blev udvidet til karakterisering af Klamydia trachomatis inklusion membran proteiner⁵ .

Denne protokol kan opdeles i to hoveddele: 1) gær toksicitet skærm, hvor bakterien Effector protein af interesse udtrykkes i gær og kloner er screenet for en toksisk fænotype som det fremgår af en vækst defekt, og 2) gær suppressor skærmen , hvor den giftige fænotype er undertrykt ved udtryk af en gær genomisk bibliotek i den giftige stamme. Således toksicitet skærmen er en skærm for giftige fænotyper, der manifesterer sig som vækst defekter, når den bakterielle Effector af interesse er overudtrykt. Giftige kloner, med succes omdannet med og udtrykker den bakterielle Effector, er valgt og gemt til næste trin. Det andet store skridt består i at over udtrykke et delvist fordøjet gærgenomisk bibliotek i den giftige gærklon. Plasmider, der udgør gær genomisk bibliotek foreslået til brug i denne protokol bære 5 − 20 kb skær, normalt svarer til 3 − 13 gær åbne læse rammer (ORF) af en gennemsnitlig gen størrelse af ~ 1,5 KB på tværs af alle plasmider, der repræsenterer hele gær genom dækket ca. 10x. Denne del af analysen kaldes suppressor skærmen, da målet er at undertrykke toksiciteten af bakterien Effector protein. Potentielle suppressor plasmider isoleres fra gær, sekvenserede og undertrykkende Orf’er identificeret. Rationalet bag suppressor-skærmen er, at Effector-proteinet binder, interagerer med og/eller overvælder komponenterne i værts vejen, det er rettet mod, og at det at give disse værts proteiner tilbage i overskud kan redde den toksiske virkning på vejen og dermed vækst defekten. Således identificerede Orf’er, der undertrykker toksicitet ofte repræsenterer flere deltagere i en vært pathway. Ortogonale eksperimenter udføres derefter for at kontrollere, at bakterien Effector faktisk interagerer med den implicerede vej. Dette er især nødvendigt, hvis en bindende partner som clathrin eller actin er blevet identificeret, fordi disse proteiner er involveret i en lang række værts processer. Yderligere eksperimenter kan så belyse den fysiologiske funktion af Effector protein under infektion. Toksiciteten og suppressor skærmene er også kraftfulde værktøjer til at afskærme den fysiologiske funktion af bakterielle Effector proteiner, der ikke fysisk binder værts proteiner med tilhørsforhold, der er tilstrækkelige til at detektere ved immunopræcipitation, eller som interagerer med Host i enzymatiske hit-and-run interaktioner, der ikke kan påvises ved en gær-to hybrid skærm.

Selv om suppressor skærmen kan være en kraftfuld metode til at afsløre potentielle fysiologiske interaktioner mellem bakterielle Effector proteiner og værts veje, den bakterielle Effector protein skal fremkalde en vækst defekt i gær, ellers bruge det i suppressor skærm vil være til meget lidt brug. Desuden skal den toksiske fænotype resultere i mindst en 2 − 3 log₁₀ underskud i vækst, eller det vil være vanskeligt at identificere suppressorer. Hvis et laboratorium er oprettet for cellekultur, screening Effector proteiner for toksicitet i fælles cellelinjer som HeLa kan ofte give indsigt i, om det er umagen værd at gå videre med gær toksicitet skærmen. Ectopic ekspression af Effector protein i HeLa celler undertiden resulterer i toksicitet, der korrelerer meget stærkt med toksicitet i gærstammen anvendes til disse skærme⁴. Observerbare kendetegn af stress i HeLa celler omfatter tab af stress fibre, celle løsrivelse fra pladen, og nuklear kondensation indikerer apoptose. Enhver visuel indikation af stress i Hela-celler gør det protein af interesse en god kandidat til inducerende en vækst defekt i gær, som replikerer meget hurtigere og er dermed mere lydhør over for forstyrrelse af essentielle veje.

Det skal bemærkes, at den suppressor skærm ikke altid identificerer vært bindende partnere som undertrykkere, men det kan stadig implicere kritiske komponenter i værts vejen (r) målrettet, giver et holistisk syn på de biologiske processer, der kapret af bakteriel Effector protein. På overfladen, dette synes ulogisk, fordi at give den bindende partner af Effector protein i overskydende forventes at redde væksten defekt. I bestræbelserne på at identificere veje rettet af C. trachomatis Effector protein CT229 (cpos), som binder til mindst 10 forskellige Rab GTPases under infektion⁵, ingen af Rab bindende partnere undertrykt TOKSICITETEN af CT229. Der blev imidlertid identificeret talrige suppressorer, som var involveret i clathrin-belagt vesikelprotein-handel (CCV), hvilket førte til yderligere arbejde, der viste, at CT229 specifikt undergraver Rab-afhængig CCV-handel. Tilsvarende, når man undersøger C. burnetii Effector protein Cbu0041 (Cira) flere Rho GTPases, der reddede gærvækst defekt blev identificeret, og det blev senere konstateret, at Cira fungerer som en GTPase aktivering protein (Gap) for rhoa⁴.

Nytten af gær suppressor skærm til belyse vært veje målrettet af bakteriel Effector proteiner kan ikke overvurderes, og andre forskere forsøger at karakterisere intracellulære bakteriel Effector proteiner kan i høj grad drage fordel af disse teknikker. Disse assays er af værdi, hvis immunopræcipitationer og/eller gær-to hybrid skærme har undladt at finde en bindende partner og kan belyse, hvilke veje er målrettet af bakterien Effector protein. Her tilvejebringes detaljerede protokoller for toksicitet og suppressor skærme til at identificere vært biologiske veje målrettet af intracellulære bakteriel Effector proteiner er tilvejebragt, samt nogle af de almindelige forhindringer opleves ved brug af disse assays og deres tilsvarende løsninger.

Protocol

1. forberedelse af medier og reagenser Bemærk: pladerne skal tilberedes før analyse dagen og er gode i 1 måned. Medier og reagenser kan laves på ethvert punkt og er gode i 1 måned. Der fremstilles 1 liter glucoseopløsning (10% w/v) ved opløsning af 100 g-(+)-glucose i 800 mL destilleret vand i et 1 000 mL bægerglas. Justér lydstyrken til 1 L med destilleret vand. Filtrer gennem et 0,2 μm sterilt filter i en steril 1 L medie opbevarings flaske. Der forberedes 1 L a…

Representative Results

Før den egentlige gær suppressor skærm kan udføres, skal Effector protein af interesse testes for toksicitet i gær. Dette opnås ved at udtrykke det protein af interesse i gær under kontrol af en galactose-inducerbar promotor. Vækst på glucose (noninducerende betingelser) bør først sammenlignes for at sikre toksicitet er specifikt på grund af ekspression af det protein af interesse og er ikke en generel defekt. Som vist i figur 3manifesterer toksiciteten sig som mindre kolonier og…

Discussion

Denne protokol skitserer trin-for-trin procedurer for at identificere vært biologiske veje målrettet af bakterielle Effector proteiner ved hjælp af en modificeret gær toksicitet og suppressor skærm. Den gærstamme, der anvendes, S. cerevisiae W303, er auxotrofe for både uracil og leucin. Uracil auxotrophy af stammen bruges til at vælge gær bærer proteinet af interesse på pYesNTA-kan vektor, mens leucin auxotrophy bruges til at vælge for gær genomisk bibliotek vektor pYep13. Gær genomisk bibliotek pl…

Materials

Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galactose	MilliporeSigma	G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet PCR purification kit	ThermoFisher Scientific	K0701
GeneJet plasmid miniprep kit	Thermo	K0503
Glucose	MilliporeSigma	G8270-1KG
Herring Sperm DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Lithium acetate dihydrate	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptone	Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530
Poly(ethylene glycol) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
Tryptophan	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Yeast miniprep kit	Zymo	D2001
Yeast nitrogen base without amino acids	MilliporeSigma	Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1501-20G	without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1771-20G	without uracil, leucine, tryptophan