마이크로 혈관 구조에서 필드 와이즈 흐름의 공간 시간 분석
Summary
고속 모세관 유동 이미지 시퀀스에서 미세 혈관 흐름을 정량화하기 위해 STAFF(필드와이즈 흐름의 공간 시간 분석) 소프트웨어를 개발했습니다. 전체 이미지 필드와 시간이 지남에 따라 STAFF는 유속을 평가하고 정량분석을 위한 시각화 및 표 출력을 위해 색상으로 구분된 공간 맵 시퀀스를 생성합니다.
Abstract
혈액 흐름 속도 및 분포의 변화는 다양한 세포 요구에 반응하여 조직 및 장기 관류를 유지하는 데 필수적입니다. 또한, 미세 순환에 결함의 출현은 여러 병리의 발달의 주요 지표가 될 수 있습니다. 광학 화상 진찰에 있는 어드밴스는 살아있는 동물에 있는 세포와 sub cellular 수준에 있는 화상 진찰을 시간이 지남에 따라 고속으로 허용하는 실제적인 접근 (IVM) intravital 현미경 검사법 (IVM)를 만들었습니다. 그러나, 모세관 흐름에 있는 적당한 조직 관류, 공간 및 시간적인 가변성을 유지하는 중요성에도 불구하고 거의 문서화되지 않습니다. 표준 접근법에서는 제한된 시간 동안 이미징을 위해 소수의 모세관 세그먼트가 선택됩니다. Pii 의 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어용 매크로인 필드와이즈 플로우(STAFF)의 공간 시간적 분석을 편견 없는 방식으로 모세관 흐름을 포괄적으로 정량화했습니다. STAFF는 모세 혈관 내혈흐름의 전체 필드가 있는 고속 이미지 시퀀스를 사용하여 모든 혈관 세그먼트에 대해 시간 간격마다 kymographs라고 하는 움직임을 나타내는 이미지를 생성합니다. kymographs에서 STAFF는 적혈구가 시간이 지남에 따라 이동하는 거리에서 속도를 계산하고 정량 분석을위한 시각화 및 표 출력을위한 색상 코드 공간지도의 시퀀스로 속도 데이터를 출력합니다. 일반적인 마우스 간에서 STAFF는 소엽 내의 pericentral 및 periportal 영역 사이의 유속의 심오한 차이를 정량화분석합니다. 더 예기치 않은 것은 나란히 있는 정현파와 몇 초에 걸쳐 개별 혈관 세그먼트 내에서 보이는 변동 사이의 유속의 차이입니다. STAFF는 모세관 흐름의 복잡한 시공간 역학을 측정하여 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 강력한 새로운 도구입니다.
Introduction
미세 혈관 구조는 생리학에서 중요한 역할을하며 변화하는 조건하에서 조직의 효과적인 관류를 보장합니다. 미세혈관 기능 장애는 장기 심혈관 이환율 및 사망률, 치매의 발병, 간 및 신장 모두의 질병 등 무수한 조건과 연관되어 있으며, 따라서 광범위한 생체 의학 조사에서 관심의 핵심 요소인1,2,3,4,5. 여러 기술이 조직 관류를 평가하는 데 사용되었지만, 오직 분과 내 현미경 검사법만이 개별 모세혈관 수준에서 혈류를 특성화하는 데 필요한 시간적 및 공간 적 해상도에서 데이터 수집을 가능하게 합니다.
미세 혈관 흐름은 형광 현미경 검사법에서 형광 현미경 검사법에서 가시화 될 수 있습니다 또는 막 불과후형 형광 마커의 배경에 대한 적혈구의 움직임에 의해 (예를 들어, 형광 표지 dextran 또는 알부민)6,7. 현미경 혈관 흐름은 광시야 현미경 검사법을 사용하여 표면 세포 층에서, 또는 공초점 또는 다중 광자 현미경 검사법을 사용하여 깊이에서 심상할 수 있습니다. 그러나 모세관 유량은 적혈구의 통과가 일반적으로 60 프레임 / s 미만의 속도로 캡처 할 수 없도록합니다. 대부분의 레이저 스캐닝 공초점 및 다광자 현미경은 전체 이미지 필드를 스캔하기 위해 1-5s가 필요하기 때문에 이 속도는 일반적으로 시야를 제한하고 때로는 단일 스캔 라인8로만수행할 수 있습니다. 선택된 모세관 세그먼트(1)로 측정을 제한하는 과정은 선택 편향을 도입할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 (2) 모세관 혈류의 속도에서 공간및 시간적 이질성을 포착하는 것을 불가능하게 합니다. 이와 대조적으로, 모세관 네트워크의 이미지는 과학적인 보완 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라가 장착 된 광시야 디지털 현미경을 사용하여 100 fps를 초과하는 속도로 수집 할 수 있습니다9,10. 일반적인 생물 의학 실험실에서 흔히 볼 수 있는 이러한 저렴한 시스템은 본질적으로 지속적으로 전체 2차원 네트워크를 가로질러 미세 혈관 흐름을 이미지화할 수 있게 합니다. 문제는 고속 비디오 현미경 검사법에 의해 생성 된 거대하고 복잡한 이미지 데이터 세트에서 의미있는 정량적 데이터를 추출 할 수있는 분석 접근 방식을 찾는 중 하나가됩니다.
전체 필드 유동 데이터의 분석을 가능하게 하기 위해 고속으로 수집된 이미지 계열의 전체 현미경 필드에 걸쳐 미세 혈관 흐름을 지속적으로 측정할 수 있는 새로운 이미지 분석 소프트웨어인STAFF를 개발했습니다. 이 접근법은 다양한 다양한 실험 시스템 및 이미징 방식과 호환되며 STAFF 이미지 분석 소프트웨어는 ImageJ12의FIJI 구현을 위한 매크로 도구 세트로 구현됩니다. 미세 혈관 흐름을 시각화하기 위해 여기에 사용되는 기본 원리는 먼저, 일부 대비가 모세 혈관 내에서 적혈구를 이미지 할 수 있도록 제공되어야한다는 것입니다. 우리의 연구 결과에서, 대조는 적혈구에 의해 제외되는 대량 형광 탐사선에 의해 제공됩니다. 그런 다음 살아있는동물8로부터고속으로 수집된 이미지에서 형광표지된 플라즈마 내에서 음성 얼룩으로 나타나는 적혈구의 변위로부터 유동속도를 정량화할 수 있다. 그런 다음 STAFF를 사용하여 kymographs라는 여러 간격에 걸쳐 각 모세관 세그먼트를 따라 거리 플롯을 만들고 kymographs13에있는 경사를 감지하고 이러한 경사면에서 미세 혈관 흐름의 속도를 계산합니다. 접근은 화상 진찰을 위해 접근할 수 있는 어떤 모세관 침대에서 집합된 심상에 적용될 수 있습니다. 여기에서 우리는 간에서 혈류의 연구에 IVM과 STAFF의 적용을 기술합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에는 여러 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 간내 영상 촬영 중 움직임을 최소화하는 것은 STAFF를 사용하여 모세관 유동 분석에 사용할 수 있는 영상을 생성하는 데 필수적입니다. 다이어프램의 근접성으로 인해 짧은 호흡 유발 운동이 발생하며, 안전한 간은 각 호흡 후 초기 위치로 돌아갑니다. 거즈를 이용한 커버슬립 바닥 접시에 대해 외과적으로 노출된 간을 고정한 다음, 거꾸?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
여기에 제시된 연구 결과는 건강의 국가 학회 (NIH U01 GM111243 및 NIH NIH NIDDK P30 DK079312)에서 자금조달에 의해 지원되었습니다. 생체 내 현미경 검사법 연구는 인디애나 생물 현미경 검사법 센터에서 수행되었습니다. 말고르자타 카모카 박사에게 현미경 검사법 기술 지원에 감사드립니다.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
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