斑马鱼胚胎全山原位杂交和管状测定在iPSC-ECs中研究恩多林在血管发育中的作用

Summary

本文介绍的是一种在斑马鱼和管状细胞中对斑马鱼进行全位RNA杂交分析的协议，在患者诱导的多能干细胞衍生内皮细胞中进行管状分析，以研究内索林在血管形成中的作用。

Abstract

血管发育由特定基因的连续表达决定，可在不同发育阶段对斑马鱼进行原位杂交测定进行研究。为了研究在遗传性出血性特朗吉性（HHT）发展过程中，在血管形成中的作用，利用斑马鱼中拟定的定向击倒来研究其时间表达和相关功能。在这里，全位原地RNA杂交（WISH）用于分析斑马鱼胚胎中的eng及其下游基因。此外，在HHT患者诱导多能干细胞分化内皮细胞（iPSC-ECs;具有eng突变）中进行管状检测。使用整量原位杂交的特定信号放大系统 – 与传统方法相比，WISH 可提供更高的分辨率和更低的背景效果。为了获得更好的信号，在探头杂交后，固定后时间将调整为30分钟。由于荧光染色在斑马鱼胚胎中不敏感，因此在这里被二氨基丁（DAB）染色所取代。在此协议中，含有eng突变的HHT患者衍生iPSC系分化成内皮细胞。在37°C下涂了30分钟的基底膜基质后，iPSC-EC作为单层播种成井，并保持在37°C3小时。然后，使用微观图像计算管长和分支数。因此，通过这种改进的WISH协议，表明减少的英性表达会影响斑马鱼胚胎的内皮祖祖形成。这进一步证实了使用从HHT患者的iPSC-ECs的管形测定。这些测定证实了eng在早期血管发育中的作用。

Introduction

在HHT患者中eng报告了eng（CD105）的单突变。突变导致EC增殖增加和减少流动介导EC伸长^11，2。2也曾报道，ENG缺乏减少内皮标记表达（即，kdrl，cdh5，嘿2）在斑马鱼cdh5^3。Endoglin，主要以内皮细胞表示，是一种跨膜糖蛋白，是转化生长因子β（TGF-+）家庭成员的共同受体。它引导BMP9结合在细胞表面，以调节下游基因，包括Id1表达，诱导干细胞分化到^ECs4。因此，eng基因在血管生成和人类血管疾病^55、66中起着重要的作用。我们以前曾研究过苯丙烯酶在斑马鱼胚胎中撞击血管形成的影响，然后分析从具有eng突变⁷的HHT患者那里获得的iPSCs衍生的ECs。该协议演示了ENG缺乏对内皮祖体标记表达和管的形成的影响，这是一种测量体外血管生成的方法。

为了研究英语空间和时间表达，WISH用于检测体内基因表达^8。原位杂交 （ISH） 是一种使用带有目标核酸（DNA 或 mRNA）补充序列的标签探头来检测和可视化固定试样中的目标核酸混合物的方法。该过程放大体内的基因表达信号，用于通过显微镜检测基因的表达。WISH已广泛应用于各种模型动物，特别是在斑马鱼^9。它还用于获取以下数据：1）基因空间/时间表达模式，提供有关基因功能和分类的信息;和2）专门表示基因标记，用于高通量药物或突变筛选^10。

色谱探针容易降解与传统的染色体原位杂交（CISH），导致高背景噪声和非特异性信号^{11，12。11,}WISH方法使用两个独立的双Z探针，它们被设计成杂交以靶向RNA序列。每个探针包含一个与目标RNA互补的18-25序列和14个基尾序列（概念化为Z）。目标探头用于对（双 Z）。两个尾部序列共同形成前置放大器的 28 个基本混合站点，其中包含 20 个放大器的绑定位点。放大器，反过来，包含20个结合点的标签探头，理论上可以产生高达8，000个标签为每个目标RNA序列。

这一先进技术有助于同时进行信号放大和背景抑制，实现单分子可视化，同时保持组织形态^13。WISH方法的进一步修改是基于先前的研究^14，包括额外的固定和DAB染色。此处提供了改进的 WISH 协议，即使目标 RNA 部分减少或降解，也可以工作。优点包括可在 24 小时内完成，无需无 RNase 条件。信号也可以通过多个目标的多个通道同时检测，结果与不同高通量自动化平台的结果一致且兼容。

动物模型的结果没有必要反映人类发生的相同现象。ENG包含两对保守的半胱氨酸，C30-C207和C53-C182，在孤儿区形成不硫化桥梁。为了进一步研究eng在HHT患者中的作用，从HHT患者衍生的iPSC的管状检测已经在没有/有eng突变的细胞中进行（Cys30Arg，C30R）15。¹⁵在久保田等人首次报告管状实验¹⁶后，该测定已经以多种方式得到开发。它已被用于识别血管生成或抗血管生成因子，定义血管生成的信号通路，并确定调节血管生成的基因^17。

在提供患者衍生的iPSC-ECs之前，研究人员主要使用培养的酶来研究血管原体^16。然而，对于内皮细胞来说，用病毒转导外源基因是一项技术挑战，因为ECs可以经历的通道数量有限。这是因为几乎没有足够的细胞材料从人类血管收集，无论是从手术或匹配批准的捐赠者。随着iPSC生成技术的发明，由iPSC衍生的人类EC可以可靠地用于体外实验，如前¹⁸日报道。

使用病毒转导的ECs的数量和通道可能足以信号研究，但对于功能研究，最好产生突变多能干细胞系，（或iPSCs或CRISPER/Cas9目标hESCs），然后将它们区分成ECs，用于使用管形测定¹⁹的血管生成研究。管的形成可用于评估具有突变的内皮细胞的功能。该协议还描述了α-滑动血管生成板上的管状，这是一种简单、经济、可重复的方法。

下面的协议提供了一个可靠和系统的方法，用于研究特定基因在血管形成中的作用，以及体内表达模式和体外功能定量的细节，用于模拟人类疾病。

Protocol

所有动物实验均获得浙江大学医学院研究伦理委员会批准。 1. 全装原位杂交 斑马鱼线畜牧业和繁殖 在循环水产养殖系统中以26-28°C喂食和养殖所有成年斑马鱼，每天以14小时光/10小时暗循环。使用 AB（野生类型）斑马鱼线执行以下操作。 在繁殖箱底部放一层鹅卵石作为卵子的庇护所。将父母鱼的比例为2：1（即，两只雌性鱼和一只雄性鱼）放入每个盒子…

Representative Results

整个原位杂交基于类似于荧光共振能量传递的原理。它旨在提高斑马鱼ISH的灵敏度和特异性，并在不影响背景信号的情况下放大目标特异性信号。 在24个hpf斑马鱼胚胎中，在后侧基静脉（PCV）、分段血管（ISV）和血岛3中高度表达。在传统的色原原位杂交（CISH）中，很难控制染色时间，在一些地区出现?…

Discussion

该协议在HHT患者的iPSC-ECs上应用了改进的全位RNA分析平台，用于斑马鱼和管状检测。传统的ISH方法需要更长的实验周期和额外的实验步骤。该协议有一些重要的改进，分别使用独立双Z探头和iPSC从HHT患者身上获得，分别应用于WISH测定和管状。与传统 ISH 相比，这些改进对于提高检测灵敏度至关重要。独特的设计探头和目标信号放大允许检测很少表达的转录（aplnra是24个hpf胚胎中表达不良的基?…

Materials

µ-Slide Angiogenesis	ibidi	81506	Cell culture
Amp 1-FL	ACD	SDS 320852	Signal Amplification
Amp 2-FL	ACD	SDS 320853	Signal Amplification
Amp 3-FL	ACD	SDS 320854	Signal Amplification
Amp 4 Alt B-FL	ACD	SDS 320856	Signal Amplification
Corning Matrigel Matrix	Corning	354234	Growth factor-reduced Matrigel
DEPC	Sigma	D5758	RNAase-free Water
Human Endothelial-SFM	Thermofisher	11111044	Cell culture
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Fixed embryos
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Fixed Cells
Protease K	ACD	SDS 322337	Digest tissue
Sodium Citrate	Sigma	6132-04-3	SSCT solution: Wash Buffer
VEGF-165	STEMCELL Technologies	78073	Growth factor