제시된 프로토콜은 유세포측정을 사용하여 배양된 마우스 장용체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화합니다. 이 방법은 약물 치료가 오르가노이드 증식 및 생존에 미치는 영향을 평가하는 데 도움이 된다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
장 상피는 병원성 미생물및 독소와 같은 발광 체질이 신체의 나머지 부분으로 들어가는 것을 방지하는 장벽 역할을합니다. 상피 장벽 기능은 장 상피 세포의 무결성을 필요로한다. 상피 세포 증식 장벽을 형성 하는 세포의 지속적인 층을 유지 하는 동안, 상피 손상 장벽 기능 장애에 이르게. 그 결과, 발광 내용물제한없는 통로를 통해 장 장벽을 가로 질러 수 있습니다. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환과 같은 많은 장 질환과 관련이 있습니다. 고립 된 마우스 장 지하실배양 및 창 자-villus 같은 구조로 유지 될 수 있습니다., 장 오르가노이드 또는 "엔터 로이드"라고. 엔터로이드는 시험관 내에서 장 상피 세포의 증식 및 세포 사멸을 연구하는 데 이상적입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 배양된 장체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화하는 간단한 방법을 기술한다. 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU) 및 프로피듐 요오드화물은 장신구의 증식 및 죽은 세포에 라벨을 붙이기 위해 사용되며, 증식 및 죽은 세포의 비율은 유세포측정에 의해 분석됩니다. 이것은 장 상피 세포 증식 및 세포 생존에 대한 약물 치료의 효과를 테스트하는 유용한 도구입니다.
서론
장 상피 세포의 기본 기능은 병원성 박테리아 및 독소와 같은 발광 내용물의 진입을 보호하는 것입니다1,2. 이러한 기능을 수행하기 위해, 장줄기세포는 연속적으로 증식하고, 장세포 및 분비세포를 포함한 다양한 상피세포로 분화하며, 이는 단단한 연결을 형성하여 장벽을 형성한다3. 장 상피 세포의 급속한 갱신은 세포 증식, 세포 분화 및 세포 사멸의 엄격한조정을필요로4,5. 감소된 세포 증식 또는 과도한 세포 사멸은 상피 손상 및 손상된 장벽 기능1,6. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환7,8과관련이 있습니다.
장 내 지하실을 배양하는 방법이 이전에 개발되었습니다. 이 기술을 사용하여, 고립 된 마우스 토굴은 구조와 같은 토굴 - 융모를 가지고 모든 장 상피 세포 계보를 포함하는 장 오....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 프로토콜은 수코 대학의 케임브리지 수다 게놈 자원 센터 (CAM-SU)의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 장 오르가노이드 분리 및 문화
- 장 지하실과 장 내 문화의 격리
- CO2 흡입으로 8주된 야생형 마우스를 안락사시. 티슈 집게와 미세 홍채 가위를 사용하여 약 8cm의 장틀을 해부하십시오.
- 약 40 mL의 얼음 차가운 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)와 함께 주입식 바늘을 사용하여 주사기를 사용하여 씻어 낸 다음 가위로 세로로 자르고 장틀을 엽니다.
- 작은 (0.5-1.0 cm) 조각으로 장수를 잘라. 멸균 된 얼음 차가운 DPBS 5 mL에 15 mL 원추형 튜브에 넣고 얼음에 5 분 동안 바위를 놓습니다.
- 파이펫 컨트롤러를 사용하여 DPBS를 흡인하고 10mL의 콜드 버퍼 1(DPBS의 2mM EDTA)으로 교체합니다. 얼음에 30 분 동안 바위.
- 파이펫 컨트롤러를 사용하여 버퍼 1을 흡인하고 10 mL의 콜드 버퍼 2 (54.9 mM D-소르비톨, DPBS에서 43.4 mM 자당)로 교체하십시오. 손으로 2-3 분 동안 흔들어주세요 (~80 쉐이크 / 분).
- 흔....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
소장 지하실은 지하 막 매트릭스에서 장내 세균으로 분리되고 배양되었다. 엔터로이드는 격리 후 2 일 싹을 형성하기 시작했다. 6 일째에 엔터로이드는 루멘에 많은 파편 (죽은 세포)이많은 싹을 가지고 있었습니다. 엔터로이드는 이 단계에서 통과될 준비가되었다(그림 3).
수많은 연구에 따르면 염증성 사이토카인은 장 상피 항상성의 유지에 필수적입니다. 염증성 사이토카인의 비정상적인 발현은 염증성 장 질환의 발생과 밀접한 관련이 있다11. 예를 들면, 우리의 이전 연구 결과는 IL-22가 수송 증폭 세포의 증식을 승진시키는 그러나 또한 Lgr5+ 줄기 세포12를고갈한다는 것을 보여주었습니다.
엔터로이드는 3일 동안 IL-22로 처리되었고, 그 후 합성 DNA를 세포 증식을 나타내기.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 유세포측정에 의한 장내 EdU-및 PI 양성 세포의 시험관 내 및 정량화 및 엔테로이드의 배양에 필요한 단계를 상세히 설명한다. 이 전략에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, EdU 라벨링은 장체에서 증식 세포를 검출하는 데 사용됩니다. 기존의 BrdU 분석법에 비해 EdU 라벨링 방법은 더 빠르고 민감하며 더 정확합니다. EdU는 세포 분열 도중 DNA 종합에 있는 티민을 대체하는 티민 (T)와 아주 유사합니다. BrdU 항체에 비해, EdU는 세포 내로 확산하기 쉽고, EdU의 검출은 DNA 변성 및 항원 항체 반응을 필요로 하지 않는다. 둘째, 유세포 분석 분석은 장용체내의 증식(EdU+)및 죽은(PI+) 세포를 신속하고 정확하게 정량화할 수 있다.
전체 절차를 성공적으로 수행하기 위해 고려해야 할 중요한 측면이 있습니다. 첫째, 충분한 조건 하에서 장체를 배양하는 것이 중요하다. 잘 자란 엔터노이드는 증식 세포를 포함하.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단 (31971062, 31900322, 31600322), 장쑤성 자연 과학 재단 (BK20190043, BK20180838), 제약 생명 공학의 국가 핵심 연구소의 연구 기금, 난징 대학 (KF-GN-202004). 중국 장쑤 고등 교육 기관의 자연 과학 재단 (19KJB320003), 소주 시의 생계 및 기술 프로그램 (SYS2019030), 그리고 장쑤성 대학 졸업생을위한 연구 혁신 프로그램 (KYCX19-1981) . 이 작품은 또한 소차우 대학의 당학장에 의해 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 원심분리기 튜브 | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml 원심분리기 tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| 고급 DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT 음향 집속 유세포분석기 | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | DPBS Buffer 2 | ||
| mM EDTA 54.9 mM D-sorbitol, DPBS | |||
| 마우스 | 의 43.4 mM 자당난징 대학교 난징 생물 | ||
| 세포 해리 효소(TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5424 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5424R | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life 과학 기술 | C10639 | |
| CO2 인큐베이터 | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | ||
| D-소르비톨 | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR 배지 | 미니거트 배지, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| 소 태아 혈청(FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| 미세 홍채 가위 | Tansoole | 2037454 | |
| 형광 현미경 | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX 보충제 | GIBCO | 35050-061 | |
| 염소 혈청 | 생명 기술 | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut 배지 | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R& D | AR009 | |
| 비이온 성 계면 활성제 (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| 작동 가위 (12.5cm) | Tansoole | 2025785 | |
| 파라 포름 알데히드 (PFA) | 시그마 | 158127-500g | |
| Penn / Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| 위상차 현미경 | Nikon | TS1000 | |
| 프로피듐 요오드화물 | 시그마 | P4170-25MG | |
| 재조합 EGF | PeproTech | 315-09 | |
| 재조합 마우스 Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| 재조합 마우스 R-Spondin 1 | R& D | 3474-RS-050 | |
| 재조합 쥐 IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| 자당 | BBI SB0498 | ||
| 조직 겸 | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
참고문헌
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regu....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
