الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية النوع 1 (HIV-1) البروتين انتيسنس (ASP) الحمض الريبي النيبالي المستنسخات في المرضي التي كتبها RT-PCR الخاصة
Summary
يمكن لدبابيس الشعر RNA والحلقات تعمل كالاشعال للنسخ العكسي (RT) في غياب الإشعال تسلسل محدده ، تتداخل مع دراسة المستنسخات انتيسنس متداخلة. وقد وضعنا تقنيه قادره علي تحديد الحمض الريبي النيبالي محدده حبلا ، ونحن قد استخدمت لدراسة فيروس نقص المناعة الذاتية-1 البروتين انتيسنس ASP.
Abstract
في الفيروسات الرجعية, وقد وصفت النسخ انتيسنس في كل من فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (فيروس العوز المناعي البشري-1) والإنسان T-اللمفاوية الفيروس 1 (HTLV-1). في فيروس نقص المناعة الذاتية-1 ، ويقع الجينات المضادة للتحسس ASP البروتين علي حبلا السلبية من البيئية ، في اطار القراءة-2 ، التي تغطي تقاطع gp120/gp41. في اتجاه المعني ، تتداخل نهاية 3 ‘ من ASP فتح اطار القراءة مع gp120 المناطق المتغيرة بشكل مفرط V4 و V5. وقد أحبطت دراسة الجيش النيبالي الريبي من قبل ظاهره المعروفة باسم RT-فتيله الذاتي, حيث الهياكل الثانوية RNA لديها القدرة علي رئيس الوزراء RT في غياب التمهيدي محدده, توليد cDNAs غير محدده. الاستخدام المشترك لل RNA عاليه المسخ مع الإشعال العكسي بيوتينيلاتيد في رد فعل RT ، جنبا إلى جنب مع تنقيه تقارب cDNA علي الخرز المغناطيسي المغلفة العقديات ، سمح لنا بشكل انتقائي تضخيم الحمض الريبي النيبالي في الخلايا التائية المشتقة من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة المكتسب-1. طريقتنا هي منخفضه التكلفة نسبيا ، بسيطه لأداء ، موثوق بها للغاية ، ويمكن استنساخها بسهوله. وفي هذا الصدد ، فانه يمثل أداه قويه لدراسة النسخ المضادة للتحسس ليس فقط في فيروس نقص المناعة الطبيعية-1 ولكن أيضا في النظم البيولوجية الأخرى.
Introduction
الجينات البروتين انتيسنس (ASP) هو اطار القراءة المفتوحة (ORF) الموجود علي حبلا السلبية من نوع فيروس نقص المناعة البشرية 1 (الفيروس-1) الظرف (البيئية) الجينات ، التي تغطي تقاطع gp120/gp411. وعلي مدي السنوات الثلاثين الماضية ، أظهرت عده تقارير ان الجينات المصابة بفيروس نقص المناعة الوراثية قد كتبت وترجمت في الواقع2و3و4و5و6و7و8و9. علي الرغم من ان النصوص المضادة للتحسس ASP قد تميزت تماما في المختبر, حتى وقت قريب المعلومات حول الإنتاج الفعلي من الجيش النيبالي الريبي في المرضي كان لا يزال مفقودا.
تسلسل ASP عكس ومكمله إلى البيئية. يمثل هذا عقبه رئيسيه عند محاولة الكشف عن النسخ المستنسخة ل ASP. تستخدم أساليب النسخ العكسي القياسية-تفاعل البلمره المتسلسل (RT-PCR) الإشعال المضاد للتحسس الخاص بالجينات لتوليف DNAs التكميلية (cDNAs) القطبية الصحيحة. هذا النهج ، ومع ذلك ، لا يسمح لتحديد التوجه (الشعور أو انتيسنس) من النموذج الاولي الحمض الريبي النيبالي ، منذ الحمض الريبي النيبالي أو حلقات يمكن رئيس الوزراء RT في كلا الاتجاهين في غياب الإشعال10، وهي ظاهره تعرف باسم rt الذاتي فتيله. معظم المحققين ASP الجانبية مشكله RT الذاتي فتيله باستخدام الإشعال الموسومة مع تسلسل التي لا تتعلق بفيروس نقص المناعة الشخصية-111,12. ومع ذلك ، فان هذه الاستراتيجية لا تقضي علي حدوث هذه الظاهرة ، وقد تؤدي إلى احتمال ترحيل cDNAs غير محدده إلى الطراز PCR11.
وقد قمنا مؤخرا بتطوير رواية RT-PCR الخاصة الجديدة لدراسة الحمض الريبي المضاد للتحسس ، وقد استخدمناه للكشف عن الحمض الريبي النيبالي في فوج من سته مرضي مصابين بفيروس نقص المناعة المناعية ، كما هو مبين في الجدول 1. وقد سبق ان نشر أنطونيو مانكارييلا وآخرون13الاجراء الموصوف أدناه. في بروتوكولنا ، ونحن تجنب إنتاج cDNAs غير محدده بواسطة نهج مزدوج. أولا ، ونحن القضاء علي الهياكل الثانوية الجيش النيبالي الريبي عن طريق التخلص من الجيش النيبالي الريبي في درجه حرارة عاليه (94 درجه مئوية) ، وثانيا ، ونحن عكس نسخ الحمض الريبي النيبالي ASP باستخدام التمهيدي المحددة ASP الحيوية وتقارب-تنقيه cDNA الناتجة. من خلال هذا النهج ، ونحن قادرون علي تضخيم فقط لدينا الهدف cDNA ، لان غيرها من المنتجات RT غير محدده اما منعت من ان تتولد (ارتفاع درجه حرارة المسخ من RNA) أو القضاء عليها قبل PCR (التقارب تنقيه).
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا التقرير ونحن وصف الفحص RT حبلا محدده تطبيقها علي الكشف عن الجيش النيبالي الريبي في الخلايا المعزولة من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذاتية-1. حدوث فتيله غير محدده اثناء RT يعوق الكشف عن النسخ الحمض الريبي النيبالي مع القطبية الحق ، مما يؤدي إلى سوء تفسير النتائج. وقد وضعت المج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر السيدة باتريزيا إميليو ، وندرا نوتو ، وكريج فينويك ، وماتثيو بيرو لكونها دائما متاحه لمناقشه عملنا وجميع الناس في مختبر الإيدز المناعي لمساعدتهم التقنية الثمينة. نود أيضا ان نشكر جون وهارون Weddle من شركه VSB المرتبطة التي ساهمت مع الاعمال الفنية الممتازة. وأخيرا ، العديد من الشكر الخاص لجميع المرضي ، الذين بدونهم هذا العمل لم يكن ممكنا. ولم يتلق هذا العمل اي منحه محدده من اي وكاله تمويل.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
References
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
- Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
- Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
- Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
- Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
- Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
- Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
- Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
- Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
- Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
- Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
- Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
- Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
- Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
- Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
- Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).
