Nachweis von Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts bei Patienten durch Strand-spezifische RT-PCR
Summary
RNA-Haarnadeln und -schleifen können als Primer für die Reverse-Transkription (RT) in Ermangelung sequenzspezifischer Primer fungieren, was die Untersuchung überlappender Antisense-Transkripte beeinträchtigt. Wir haben eine Technik entwickelt, die in der Lage ist, strangspezifische RNA zu identifizieren, und wir haben sie verwendet, um DAS HIV-1-Antisense-Protein ASP zu untersuchen.
Abstract
Bei Retroviren wurde die Antisense-Transkription sowohl beim humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) als auch beim humanen T-Lymphotropen Virus 1 (HTLV-1) beschrieben. In HIV-1 befindet sich das Antisense-Protein ASP-Gen auf dem negativen Strang von env, im Leserahmen -2, der die Kreuzung gp120/gp41 überspannt. In der Sinnesorientierung überlappt sich das 3′ Ende des offenen ASP-Leserahmens mit den hypervariablen gp120-Bereichen V4 und V5. Die Untersuchung von ASP-RNA wurde durch ein Phänomen vereitelt, das als RT-Selbstgrundierung bekannt ist, wobei RNA-Sekundärstrukturen die Fähigkeit haben, RT in Abwesenheit des spezifischen Primers zu grundieren und unspezifische cDNAs zu erzeugen. Die kombinierte Verwendung einer hohen RNA-Denaturierung mit biotinylierten Reverseprimern in der RT-Reaktion, zusammen mit der Affinitätsreinigung der cDNA auf Streptavidin-beschichtete Magnetperlen, hat es uns ermöglicht, ASP-RNA in CD4+ T-Zellen, die von mit HIV-1 infizierten Personen stammen, selektiv zu verstärken. Unsere Methode ist relativ kostengünstig, einfach durchzuführen, sehr zuverlässig und leicht reproduzierbar. In dieser Hinsicht stellt es ein wirksames Instrument zur Untersuchung der Antisense-Transkription nicht nur bei HIV-1, sondern auch in anderen biologischen Systemen dar.
Introduction
Das Antisense-Protein (ASP)-Gen ist ein offener Leserahmen (ORF), der sich auf dem negativen Strang des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) Hüllkurve (env) befindet und die Kreuzung gp120/gp411überspannt. In den letzten 30 Jahren haben mehrere Berichte gezeigt, dass das HIV-ASP-Gen tatsächlich transkribiert und übersetzt ist2,3,4,5,6,7,8,9. Obwohl ASP Antisense Transkripte in vitrovollständig charakterisiert wurden, fehlten bis vor kurzem Informationen über die tatsächliche Produktion von ASP-RNA bei Patienten noch.
Die Reihenfolge von ASP ist umgekehrt und komplementär zu env. Dies stellt ein großes Hindernis beim Versuch dar, Transkripte für ASP zu erkennen. Standard-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktions-Methoden (RT-PCR) verwenden genspezifische Antisense-Primer, um komplementäre DNAs (cDNAs) der rechten Polarität zu synthetisieren. Dieser Ansatz erlaubt es jedoch nicht, die Ausrichtung (Sinn oder Antisense) der ursprünglichen RNA-Vorlage zu bestimmen, da RNA-Haarnadeln oder -schleifen RT in beide Richtungen ohne Primer10primieren können, ein Phänomen, das als RT-Selbstgrundierung bekannt ist. Die meisten ASP-Ermittler umgehen das Problem der RT-Selbstansaugung mit Primern, die mit Sequenzen markiert sind, die nichts mit HIV-11,12zu tun haben. Diese Strategie beseitigt jedoch nicht das Auftreten des Phänomens und kann zu einer möglichen Übertragung unspezifischer cDNAs in die PCR11führen.
Wir haben vor kurzem einen neuartigen strangspezifischen RT-PCR-Assay für die Untersuchung von Antisense-RNA entwickelt und für den ASP-RNA-Nachweis in einer Kohorte von sechs HIV-infizierten Patienten verwendet, wie in Tabelle 1dargestellt. Das unten beschriebene Verfahren wurde bereits von Antonio Mancarella et al.13veröffentlicht. In unserem Protokoll vermeiden wir die Produktion von unspezifischen cDNAs durch einen dualen Ansatz. Erstens eliminieren wir RNA-Sekundärstrukturen durch Denaturierung von RNA bei hoher Temperatur (94 °C), und zweitens transkribieren wir ASP-RNA mit einem biotinylierten ASP-spezifischen Primer und affinitätsreinigen die resultierende cDNA. Mit diesem Ansatz sind wir in der Lage, nur unsere Ziel-cDNA zu verstärken, da andere unspezifische RT-Produkte entweder daran gehindert werden, erzeugt zu werden (Hochtemperatur-Denaturierung der RNA) oder vor PCR (Affinitätsreinigung) eliminiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht beschreiben wir einen strangspezifischen RT-Assay, der auf den Nachweis von ASP-RNA in CD4+ T-Zellen angewendet wird, die von Personen isoliert wurden, die mit HIV-1 infiziert sind. Das Auftreten einer unspezifischen Grundierung während RT behindert den Nachweis von RNA-Transkripten mit der richtigen Polarität, was zu einer Fehlinterpretation der Ergebnisse führt. Frühere Gruppen haben mehrere Strategien entwickelt, um die grundunabhängige cDNA-Synthese während der RT-Reaktion zu verhindern. Das M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick und Matthieu Perreau für ihre stets verfügbare Arbeit und alle Menschen im Labor für AIDS-Immunpathogenese für ihre wertvolle technische Hilfe. Wir möchten uns auch bei John und Aaron Weddle von VSB Associated Inc. bedanken, die mit exzellenten Kunstwerken beigetragen haben. Abschließend noch herzlichen Dank an alle Patienten, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Diese Arbeit erhielt keinen spezifischen Zuschuss von einer Förderstelle.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
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