זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR
Summary
הסיכות ולולאות של RNA יכולות לתפקד כצבעי יסוד לתמלול הפוכה (RT) בהיעדר התחל העצמי הספציפי ברצף, הפרעה למחקר של התעתיקים החופפים של התמלילים. פיתחנו טכניקה מסוגל לזהות את ה-RNA ספציפי סטרנד, ואנחנו השתמשנו בו כדי ללמוד HIV-1 antisense חלבון ASP.
Abstract
ב retroviruses, שעתוק החושים שתוארו בנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) ו-T-lymphotropic וירוס 1 (HTLV-1). ב-HIV -1, החלבון antisense של ASP גן ממוקם על סטרנד שלילי של env, במסגרת הקריאה -2, הפורש את הצומת gp120/gp41. בכיוון ההגיון, הקצה של 3 מסגרת הקריאה של ASP חופף עם V4 של אזורים gp120-משתנים ומספר V5. המחקר של ה-RNA ASP סוכלה על ידי תופעה המכונה RT-self-הטרמה, לפיו מבנים משניים RNA יש את היכולת הממשלה RT בהעדר של פריימר ספציפי, יצירת cDNAs לא ספציפי. השימוש המשולב בשילוב עם כדורי היסוד הפוכים ביולוגית בתגובת RT, יחד עם האהדה לטיהור של cDNA על streptavidin מצופה חרוזים מגנטיים, אפשרה לנו באופן סלקטיבי להגביר את ה-RNA של ASP בתאים CD4 + T נגזר מאנשים נגועים ב-HIV-1. השיטה שלנו היא בעלות נמוכה יחסית, פשוט לבצע, מאוד אמין, ובקלות להיות מתוכדל. במובן זה, הוא מייצג כלי רב עוצמה לחקר שעתוק החושים לא רק ב-HIV-1 אלא גם במערכות ביולוגיות אחרות.
Introduction
החלבון antisense (ASP) הגן הוא מסגרת קריאה פתוחה (ORF) הממוקם על סטרנד שלילי של הנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) המעטפה (env) גן, הפורש את הצומת gp120/gp411. במהלך 30 השנים האחרונות, מספר דיווחים הראו כי הגן HIV ASP הוא אכן מועתק ותורגם2,3,4,5,6,7,8,9. למרות התעתיקים של ASP antisense כבר מאופיין באופן מלא בתוך מבחנה, עד לאחרונה מידע על הייצור בפועל של ה-RNA של ASP בחולים עדיין חסר.
הרצף של ASP הוא הפוך ומשלים ל-env. זה מייצג מכשול גדול כאשר מנסים לזהות תעתיקים של ASP. שיטת הפוך סטנדרטית לתגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) שיטות משתמשות גנטית ספציפית אנטי הגיון לסנתז DNAs משלימה (cDNAs) של הקוטביות הימנית. גישה זו, לעומת זאת, אינה מאפשרת לקבוע את הכיוון (תחושה או אנטי-היגיון) של תבנית ה-RNA הראשונית, מכיוון שסיכות או לולאות של RNA יכולות להיות מראש בשני הכיוונים בהעדר התחל10, תופעה הידועה כ-RT-הטרמה עצמית. רוב החוקרים ASP הבעיה של RT הטרמה עצמית באמצעות תחל מתויג עם רצפים שאינם קשורים ל-HIV-111,12. אסטרטגיה זו, עם זאת, אינה מבטלת את התרחשות התופעה, ועלולה לגרום לנשיאה פוטנציאלית של cDNAs שאינו ספציפי ל-PCR11.
פיתחנו לאחרונה הרומן מיוחד סטרנד-PCR שיטת המחקר של RNA antisense ואנחנו השתמשנו בו עבור הזיהוי של ה-RNA ASP בקבוצה של שישה חולים נגועים באיידס, כפי שמוצג בטבלה 1. ההליך המתואר להלן פורסם בעבר על ידי אנטוניו Mancarella ואח ‘13. בפרוטוקול שלנו, אנו נמנעים מהפקת cDNAs לא ספציפי באמצעות גישה כפולה. ראשית, אנו מסלקים מבנים משניים של RNA על ידי שימוש ב-RNA בטמפרטורה גבוהה (94 ° c), ושנית, אנו הפוכה להפוך את ה-RNA של ASP באמצעות פריימר ביולוגי ברמה של ASP ואהדה-לטהר את התוצאה cDNA. על-ידי גישה זו, אנו מסוגלים להגביר רק את היעד שלנו cdna, מאז מוצרי RT אחרים שאינם ספציפיים מנועים או שנוצר (הטמפרטורה הגבוהה דנטורציה של RNA) או נמחק לפני ה-PCR (טיהור האהדה).
Protocol
Representative Results
Discussion
בדוח זה אנו מתארים שיטת ה-RT הספציפית לסטרנד המוחלת על איתור RNA של ASP בתאים CD4 + T מבודדים מאנשים שנדבקו ב-HIV-1. התרחשות של הטרמה לא ספציפית במהלך RT הסלים את הזיהוי של התעתיקים RNA עם הקוטביות הימנית, המוביל וטעה של התוצאות. הקבוצות הקודמות פיתחו מספר אסטרטגיות שמטרתן למנוע סינתזה בלתי תלויה cDNA במ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפטריזיה אמגליו, אלסנדרה נוואל, קרייג פנוויק, ומתיו פרברו, שתמיד יהיו זמינים לדון בעבודתנו ובכל האנשים במעבדת האיידס Immunopathogenesis לסיוע הטכני היקר שלהם. אנחנו גם רוצים להודות לג ואהרון וודל מ VSB המשויכים Inc. שתרמו עם יצירות אמנות מעולה. לבסוף, תודות מיוחדות רבות לכל המטופלים, מבלי שהעבודה הזאת לא הייתה אפשרית. עבודה זו לא קיבלה כל מענק ספציפי משום סוכנות מימון.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
References
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
- Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
- Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
- Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
- Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
- Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
- Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
- Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
- Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
- Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
- Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
- Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
- Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
- Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
- Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
- Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).
