स्ट्रैंड-स्पेसिफिक आरटी-पीसीआर द्वारा रोगियों में मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी-1) एंटीसेंस प्रोटीन (एएसपी) आरएनए ट्रांसक्रिप्ट का पता लगाना
Summary
आरएनए हेयरपिन और लूप अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमर की अनुपस्थिति में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) के लिए प्राइमर के रूप में कार्य कर सकते हैं, जो एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट को ओवरलैप करने के अध्ययन में हस्तक्षेप करते हैं। हमने स्ट्रैंड-स्पेसिफिक आरएनए की पहचान करने में सक्षम तकनीक विकसित की है और हमने इसका इस्तेमाल एचआईवी-1 एंटीसेंस प्रोटीन एएसपी का अध्ययन करने के लिए किया है ।
Abstract
रेट्रोवायरस में ह्यूमन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी-1) और ह्यूमन टी-लिम्फोट्रोपिक वायरस 1 (एचटीएलवी-1) दोनों में एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्शन का वर्णन किया गया है। एचआईवी-1 में एंटीसेंस प्रोटीन एएसपी जीन एनवी के निगेटिव स्ट्रैंड पर स्थित है, रीडिंग फ्रेम-2 में, जंक्शन gp120/gp41 में फैले हुए हैं । अर्थ उन्मुखीकरण में, एएसपी ओपन रीडिंग फ्रेम का 3’अंत GP120 हाइपरचर क्षेत्रों V4 और V5 के साथ ओवरलैप करता है। एएसपी आरएनए के अध्ययन को आरटी-सेल्फ-प्राइमिंग के नाम से जानी जाने वाली घटना द्वारा विफल कर दिया गया है, जिसके द्वारा आरएनए माध्यमिक संरचनाओं में विशिष्ट प्राइमर की अनुपस्थिति में प्राइम आरटी की क्षमता है, जिससे गैर-विशिष्ट सीडीएनए पैदा होता है। आरटी प्रतिक्रिया में बायोटिनी रिवर्स प्राइमर के साथ उच्च आरएनए डेनाटुरिशन का संयुक्त उपयोग, एक साथ स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों पर सीडीएनए की आत्मीयता शुद्धि के साथ, हमें एचआईवी-1 से संक्रमित व्यक्तियों से प्राप्त सीडी 4 + टी कोशिकाओं में एएसपी आरएनए को चुनिंदा रूप से बढ़ाना करने की अनुमति दी गई है। हमारी विधि अपेक्षाकृत कम लागत वाली है, प्रदर्शन करने के लिए सरल, अत्यधिक विश्वसनीय और आसानी से प्रजनन योग्य है। इस संबंध में, यह न केवल एचआईवी-1 में बल्कि अन्य जैविक प्रणालियों में एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्शन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।
Introduction
एंटीसेंस प्रोटीन (एएसपी) जीन मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी-1) लिफाफा (एनवी) जीन के नकारात्मक कतरा पर स्थित एक ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) है, जो जंक्शन gp120/gp411में फैला है । पिछले 30 वर्षों में, कई रिपोर्टों से पता चला है कि एचआईवी एएसपी जीन वास्तव में लिखित और अनुवाद2,3,4,5,6,7,8,9है । हालांकि एएसपी एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट ्स को पूरी तरह से विट्रो मेंचित्रित किया गया है, हाल ही में रोगियों में एएसपी आरएनए के वास्तविक उत्पादन के बारे में जानकारी अभी तक गायब नहीं थी।
एएसपी का क्रम रिवर्स और एनवी के पूरक है। एएसपी के लिए ट्रांसक्रिप्ट का पता लगाने की कोशिश करते समय यह एक बड़ी बाधा का प्रतिनिधित्व करता है। मानक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) विधियां सही ध्रुवता के पूरक डीएना (सीडीएनए) को संश्लेषित करने के लिए जीन-विशिष्ट एंटीसेंस प्राइमर का उपयोग करती हैं। हालांकि, यह दृष्टिकोण प्रारंभिक आरएनए टेम्पलेट के अभिविन्यास (भावना या एंटीसेंस) को निर्धारित करने की अनुमति नहीं देता है, क्योंकि आरएनए हेयरपिन या लूप प्राइमर्स10की अनुपस्थिति में दोनों दिशाओं में प्राइम आरटी कर सकते हैं, एक घटना जिसे आरटी सेल्फ-प्राइमिंग के नाम से जाना जाता है। अधिकांश एएसपी जांचकर्ता एचआईवी-111,12से संबंधित दृश्यों के साथ टैग किए गए प्राइमर का उपयोग करके आरटी स्वयं-भड़काने की समस्या को टाल देते हैं । हालांकि, यह रणनीति घटना की घटना को खत्म नहीं करती है, और पीसीआर11में गैर-विशिष्ट सीडीएनए के संभावित कैरी-ओवर का कारण बन सकती है।
हमने हाल ही में एंटीसेंस आरएनए के अध्ययन के लिए एक उपन्यास स्ट्रैंड-विशिष्ट आरटी-पीसीआर परख विकसित की है और हमने इसका उपयोग छह एचआईवी संक्रमित रोगियों की पलटन में एएसपी आरएनए डिटेक्शन के लिए किया है, जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है । नीचे वर्णित प्रक्रिया पहले एंटोनियो Mancarella एट अल13द्वारा प्रकाशित किया गया है । हमारे प्रोटोकॉल में, हम दोहरे दृष्टिकोण से गैर-विशिष्ट सीडीएनए के उत्पादन से बचते हैं। सबसे पहले, हम उच्च तापमान (94 डिग्री सेल्सियस) पर आरएनए को नद करके आरएनए माध्यमिक संरचनाओं को समाप्त करते हैं, और दूसरा, हम एक बायोटिनी एएसपी-विशिष्ट प्राइमर और आत्मीयता-परिणामी सीडीएनए को शुद्ध करने का उपयोग करके ट्रांसक्रिब एएसपी आरएनए को रिवर्स करते हैं। इस दृष्टिकोण से, हम केवल अपने लक्ष्य सीडीएनए को बढ़ाने में सक्षम हैं, क्योंकि अन्य गैर-विशिष्ट आरटी उत्पादों को या तो उत्पन्न होने से रोका जाता है (आरएनए का उच्च तापमान निंदा) या पीसीआर (आत्मीयता शुद्धि) से पहले समाप्त हो जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में हम एचआईवी-1 से संक्रमित व्यक्तियों से अलग सीडी 4 + टी कोशिकाओं में एएसपी आरएनए का पता लगाने के लिए लागू एक कतरा-विशिष्ट आरटी परख का वर्णन करते हैं । आरटी के दौरान गैर-विशिष्ट भड़काने की घटना …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पेट्रीज़िया अमेलियो, एलेसेंड्रा नोटो, क्रेग फेनविक और मैथियू पेरेउ को धन्यवाद देते हैं कि वे अपने काम और एड्स इम्यूनोपैथोजेनेसिस की प्रयोगशाला में सभी लोगों को उनकी बहुमूल्य तकनीकी सहायता के लिए हमेशा उपलब्ध रखें। हम वीएसबी एसोसिएटेड इंक से जॉन और हारून वेडल का भी शुक्रिया अदा करना चाहते हैं जिन्होंने उत्कृष्ट कलाकृति के साथ योगदान दिया। अंत में, सभी रोगियों के लिए कई विशेष धन्यवाद, जिनके बिना यह काम संभव नहीं होता। इस काम को किसी भी फंडिंग एजेंसी से कोई खास ग्रांट नहीं मिली ।
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
References
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
- Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
- Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
- Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
- Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
- Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
- Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
- Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
- Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
- Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
- Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
- Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
- Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
- Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
- Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
- Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).
