Rilevamento di trascrizioni di RNA di tipo 1 (HIV-1) di proteina antisenso (ASP) di immunodeficienza umana nei pazienti da parte di RT-PCR specifico di Strand
Summary
Le forcine e i loop di RNA possono funzionare come primer per la trascrizione inversa (RT) in assenza di primer specifici della sequenza, interferendo con lo studio delle trascrizioni antisense sovrapposte. Abbiamo sviluppato una tecnica in grado di identificare l’RNA specifico del filamento, e l’abbiamo usata per studiare la proteina antisenso HIV-1 ASP.
Abstract
Nei retrovirus, la trascrizione antisenso è stata descritta sia nel virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) che nel virus T-linfotropico umano 1 (HTLV-1). Nell’HIV-1, il gene ASP della proteina antisenso si trova sul filamento negativo di env, nel fotogramma di lettura -2, che si estende per la giunzione gp120/gp41. Nell’orientamento del senso, l’estremità 3′ del frame di lettura ASP aperto si sovrappone alle regioni ipervariabili gp120 V4 e V5. Lo studio dell’RNA ASP è stato ostacolato da un fenomeno noto come RT-self-priming, per cui le strutture secondarie dell’RNA hanno la capacità di innescare RT in assenza del primer specifico, generando cDNA non specifici. L’uso combinato dell’elevata denaturazione dell’RNA con primer inversi biotinylati nella reazione RT, insieme alla purificazione dell’affinità del cDNA su perline magnetiche rivestite di streptavidin, ci ha permesso di amplificare selettivamente l’RNA ASP nelle cellule T CD4, derivate da individui infettati da HIV-1. Il nostro metodo è relativamente a basso costo, semplice da eseguire, altamente affidabile e facilmente riproducibile. A questo proposito, rappresenta un potente strumento per lo studio della trascrizione antisenso non solo in HIV-1 ma anche in altri sistemi biologici.
Introduction
Il gene della proteina antisenso (ASP) è un telaio di lettura aperto (ORF) situato sul filamento negativo del gene dell’involucro (HIV-1) del virus dell’immunodeficienza umana, che si estende sulla giunzione gp120/gp411. Negli ultimi 30 anni, diversi rapporti hanno dimostrato che il gene ASP HIV è effettivamente trascritto e tradotto2,3,4,5,6,7,8,9. Anche se le trascrizioni antisense ASP sono state completamente caratterizzate in vitro, fino a poco tempo fa mancavano ancora informazioni sulla produzione effettiva di RNA ASP nei pazienti.
La sequenza di ASP è inversa e complementare all’ambiente di env. Questo rappresenta un ostacolo importante quando si tenta di rilevare le trascrizioni per ASP. I metodi standard di reazione a catena di trascrizione inversa (RT-PCR) utilizzano primer antisense specifici genici per sintetizzare DNA complementari (CDA) della polarità destra. Questo approccio, tuttavia, non consente di determinare l’orientamento (senso o antisenso) del modello di RNA iniziale, poiché le forcine o i loop di RNA possono innescare RT in entrambe le direzioni in assenza di primer10, un fenomeno noto come RT self-priming. La maggior parte degli investigatori ASP elude il problema dell’auto-priming RT utilizzando i primer contrassegnati con sequenze che non sono correlate all’HIV-111,12. Questa strategia, tuttavia, non elimina il verificarsi del fenomeno e può portare a potenziali riporti di cDNA non specifici nel PCR11.
Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo saggio RT-PCR specifico del filamento per lo studio dell’RNA antisenso e l’abbiamo utilizzato per il rilevamento dell’RNA ASP in una coorte di sei pazienti affetti da HIV, come mostrato nella tabella 1. La procedura descritta di seguito è stata precedentemente pubblicata da Antonio Mancarella etal. Nel nostro protocollo, evitiamo la produzione di cDNA non specifici con un duplice approccio. In primo luogo, eliminiamo le strutture secondarie dell’RNA denimentando l’RNA ad alta temperatura (94 gradi centigradi), e in secondo luogo, invertiamo l’RNA ASP utilizzando un primer biotinylato specifico di ASP e purificando l’affinità-purificailo il cDNA risultante. Con questo approccio, siamo in grado di amplificare solo il nostro cDNA target, poiché altri prodotti RT non specifici sono o impedito di essere generati (denaturazione ad alta temperatura di RNA) o eliminati prima della PCR (purificazione dell’affinità).
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto viene descritto un saggio RT specifico del filamento applicato al rilevamento dell’RNA ASP nelle cellule T CD4, isolate da individui infettati dall’HIV-1. Il verificarsi di priming non specifico durante RT ostacola la rilevazione di trascrizioni dell’RNA con la polarità destra, portando a un’errata interpretazione dei risultati. I gruppi precedenti hanno sviluppato diverse strategie volte a prevenire la sintesi cDNA indipendente dal primer durante la reazione RT. Contrassegnare l’inversione all’estrem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick e Matthieu Perreau per essere sempre disponibili a discutere del nostro lavoro e di tutte le persone del Laboratorio di AIDS Immunopatogenesi per la loro preziosa assistenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare John e Aaron Weddle di VSB Associated Inc. Infine, tanti ringraziamenti speciali a tutti i Pazienti, senza i quali questo lavoro non sarebbe stato possibile. Questo lavoro non ha ricevuto alcuna sovvenzione specifica da qualsiasi agenzia di finanziamento.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
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