鎖特異的RT-PCRによる患者におけるヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)アンチセンスタンパク質(ASP)RNA転写物の検出
Summary
RNAヘアピンおよびループは、配列特異的プライマーがない逆転写(RT)のプライマーとして機能し、アンチセンス転写物の重複の研究を妨害する。鎖特異的RNAを同定できる技術を開発し、それを用いてHIV-1アンチセンスタンパク質ASPの研究に取り入れきました。
Abstract
レトロウイルスにおいて、アンチセンス転写は、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)およびヒトTリンパ球性ウイルス1(HTLV-1)の両方に記載されている。HIV-1において、アンチセンスタンパク質ASP遺伝子は、envの陰性鎖上に位置し、読み取りフレーム-2において、接合部gp120/gp41にまたがる。意味的な向きでは、ASP オープン読み取りフレームの 3′ 終端が gp120 超可変領域 V4 および V5 と重複します。ASP RNAの研究は、RT自己プライミングとして知られている現象によって阻止され、それによってRNA二次構造は、特定のプライマーがない場合にRTをプライミングする能力を有し、非特異的cDNAを生成する。RT反応におけるビオチン化逆プライマーとの高RNA変性の併用により、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズに対するcDNAの親和性精製と共に、HIV-1に感染した個体由来のCD4+T細胞においてASP RNAを選択的に増幅することができました。当社の方法は、比較的低コストで、実行が簡単で、信頼性が高く、簡単に再現可能です。この点で、HIV-1だけでなく、他の生物学的システムにおいてもアンチセンス転写の研究のための強力なツールを表しています。
Introduction
アンチセンスタンパク質(ASP)遺伝子は、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)エンベロープ(env)遺伝子の陰性鎖上に位置する開いた読み取りフレーム(ORF)であり、接合片gp120/gp4111にまたがっている。過去30年間にわたり、HIV ASP遺伝子が実際に転写され、翻訳された2、3、4、5、6、7、8、9であることが示されています。ASPアンチセンス転写物はインビトロで完全に特徴付けられてきたが、最近まで患者におけるASP RNAの実際の産生に関する情報はまだ欠落していた。
ASP のシーケンスは逆で、env を補完します。これは、ASP のトランスクリプトを検出しようとする際の大きな障害を表します。標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法は、遺伝子特異的アンチセンスプライマーを使用して、正極性の相補的なDNA(cDNA)を合成します。しかしながら、このアプローチは、RNAヘアピンまたはループがプライマー10の不在で両方向にRTをプライミングすることができるので、初期RNAテンプレートの向き(センスまたはアンチセンス)を決定することを可能にしない、RT自己プライミングとして知られている現象である。ほとんどのASP研究者は、HIV-111、12に関連しないシーケンスでタグ付けされたプライマーを使用してRTセルフプライミングの問題を回避します。しかしながら、この戦略は、現象の発生を排除するものではなく、PCR11への非特異的CDNAの潜在的な持ち越しにつながる可能性がある。
我々は最近、アンチセンスRNAの研究のための新規な鎖特異的RT−PCRアッセイを開発し、表1に示すように、6人のHIV感染患者のコホートにおけるASP RNA検出に使用した。以下に説明する手順は、アントニオ・マンカレラら13によって以前に公開されています。このプロトコルでは、デュアルアプローチによる非特異的cDNAの生産を回避します。まず、高温(94°C)でRNAを変性させることによりRNA二次構造を排除し、次に、ビオチン化ASP特異的プライマーを用いてASP RNAを逆書き起こし、得られたcDNAをアフィニティー精製します。このアプローチにより、他の非特異的RT産物が生成されるのを防ぐか(RNAの高温変性)またはPCR(アフィニティー精製)の前に排除されるため、ターゲットcDNAのみを増幅することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本報告では、HIV-1に感染した個体から単離されたCD4+T細胞におけるASP RNAの検出に適用される鎖特異的RTアッセイについて説明する。RT中の非特異的プライミングの発生は、正しい極性を有するRNA転写物の検出を妨げ、結果の誤解釈につながる。以前のグループは、RT反応中にプライマーに依存しないcDNA合成を防止することを目的としたいくつかの戦略を開発しました。HIVに関連しない配列で3′?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
パトリツィア・アメリオ、アレッサンドラ・ノト、クレイグ・フェンウィック、マチュー・ペローは、常に私たちの仕事とエイズ免疫病原性研究所の全ての人々に、彼らの貴重な技術支援について話し合うために利用できることに感謝します。また、優れたアートワークに貢献してくれたVSBアソシエイテッド社のジョンとアーロン・ウェドルにも感謝申し上げたいと思います。最後に、この仕事は不可能だったすべての患者に多くの特別な感謝。この作業は、どの資金調達機関からも特定の助成金を受け取っていません。
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
References
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