Обнаружение вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) Антисмысление белка (ASP) РНК Стенограммы у пациентов Strand-специфический RT-PCR
Summary
РНК шпильки и петли могут функционировать в качестве праймеров для обратной транскрипции (RT) в отсутствие последовательности конкретных грунтовки, вмешиваясь в изучение перекрывающихся антисмысловых стенограмм. Мы разработали метод, способный выявлять РНК, специфичную для прядей, и мы использовали ее для изучения антисмыслового белка ВИЧ-1 ASP.
Abstract
В ретровирусах антисмысловая транскрипция была описана как в вирусе иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), так и в Т-лимфотропном вирусе человека 1 (HTLV-1). В ВИЧ-1, антисмыслового белка ASP ген расположен на отрицательной нити env, в кадре чтения -2, охватывающих соединение gp120/gp41. В смысле ориентации, 3′ конец ASP открытой рамки чтения перекрывается с gp120 гиперпеременных регионов V4 и V5. Изучение АСП РНК было сорвано явление, известное как RT-само-первичности, в котором РНК вторичных структур имеют возможность премьер RT в отсутствие конкретных грунтовки, генерации неспецифических cDNAs. Комбинированное использование высокой денатурации РНК с биотинизатированными обратными грунтовками в реакции RT, а также очищение кДНК на стрептавидин-покрытие магнитных бусинов, позволило нам селективно усилить АСП РНК в CD4 “T-клеток, полученных от лиц, инфицированных ВИЧ-1. Наш метод относительно недорогой, простой в исполнении, очень надежный и легко воспроизводимый. В этом отношении он представляет собой мощный инструмент для изучения антисмысловой транскрипции не только в ВИЧ-1, но и в других биологических системах.
Introduction
Антисмыслового белка (ASP) ген астровая рамка чтения (ORF) расположена на отрицательной нити вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) конверт (env) ген, охватывающий соединение gp120/gp411. За последние 30 лет, несколько докладов показали, что ген ВИЧ ASP действительно транскрибируется и переводится2,3,4,5,6,7,8,9. Хотя ASP антисмысл стенограммы были полностью охарактеризованы в пробирке, до недавнего времени информация о фактическом производстве ASP РНК у пациентов по-прежнему отсутствует.
Последовательность ASP обратная и дополняет env. Это представляет собой серьезное препятствие при попытке обнаружить транскрипты для ASP. Стандартные методы обратной транскрипции-полимеразы цепной реакции (RT-PCR) используют генно-специфические антисмысловые праймеры для синтеза дополнительных ДНС (cDNA) правильной полярности. Этот подход, однако, не позволяет определить ориентацию (чувство или антисмысл) первоначального шаблона РНК, так как РНК шпильки или петли могут премьер RT в обоих направлениях в отсутствие праймеров10, явление, известное как RT само-priming. Большинство следователей ASP обойти проблему RT самопремьера с помощью грунтовки помечены последовательностей, которые не связаны с ВИЧ-111,12. Эта стратегия, однако, не устраняет возникновение этого явления, и может привести к потенциальному переносу неспецифических CDNA в ПЦР11.
Недавно мы разработали новый strand-специфический RT-PCR исследование для изучения антисмысловой РНК, и мы использовали его для обнаружения ASP РНК в когорте из шести ВИЧ-инфицированных пациентов, как показано в таблице 1. Процедура, описанная ниже, была ранее опубликована Антонио Mancarella и др.13. В нашем протоколе мы избегаем производства неспецифических КДНС с помощью двойного подхода. Во-первых, мы устраняем РНК вторичных структур путем денатурации РНК при высокой температуре (94 градусов по Цельсию), а во-вторых, мы вспять транскрибирования АСП РНК с помощью биотиниляции ASP-специфической грунтовки и сродство-очистить результирующую кДНК. При таком подходе мы можем усилить только нашу целевую кДНК, так как другие неспецифические продукты RT либо предотвращаются от генерирования (высокая денатурация РНК), либо устраняются до ПЦР (очистка сродства).
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом отчете мы описываем специфический rt-расса, применяемый к обнаружению АСП РНК в клетках CD4′, изолированных от людей, инфицированных ВИЧ-1. Появление неспецифических грунтовок во время RT препятствует обнаружению РНК стенограммы с правом полярности, что приводит к неправильной инте?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Патрицию Амелио, Алессандру Ното, Крейга Фенвика и Матье Перро за то, что они всегда были доступны для обсуждения нашей работы и всех людей в Лаборатории иммунопатогенеза СПИДа за их драгоценную техническую помощь. Мы также хотели бы поблагодарить Джона и Аарона Уэддла из VSB Associated Inc., которые внесли свой вклад с отличными произведениями искусства. Наконец, большое спасибо всем пациентам, без которых эта работа была бы невозможна. Эта работа не получила никаких конкретных субсидий от какого-либо финансируемого учреждения.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
References
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
- Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
- Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
- Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
- Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
- Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
- Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
- Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
- Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
- Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
- Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
- Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
- Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
- Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
- Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
- Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).
