Detektion av humant immunbrist virus typ 1 (HIV-1) RNA-avskrifter för antisense protein (ASP) hos patienter med programspecifika RT-PCR-
Summary
RNA hårnålar och slingor kan fungera som primers för omvänd Transkription (RT) i avsaknad av sekvens-specifika primers, störa studien av överlappande antisense avskrifter. Vi har utvecklat en teknik som kan identifiera strandspecifika RNA, och vi har använt det för att studera HIV-1 antisense protein ASP.
Abstract
I retrovirus, antisense transkription har beskrivits i både humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) och humant T-lymfotropic virus 1 (HTLV-1). Vid HIV-1 ligger antisense protein ASP-genen på den negativa del av ENV, i läsramen-2, som spänner över korsningen gp120/gp41. I avkänningen orientering, 3 ‘ slutet av ASP öppna läsbild överlappar gp120 hypervariabel regioner v4 och v5. Studiet av ASP RNA har omintetgjorts av ett fenomen som kallas RT-Self-priming, varvid RNA sekundära strukturer har förmågan att Prime RT i avsaknad av den specifika primer, genererar icke-specifika cDNAs. Den kombinerade användningen av hög RNA-denaturering med biotinylerade omvänd primers i RT reaktion, tillsammans med affinitet rening av cDNA på streptavidin-belagda magnetiska pärlor, har tillåtit oss att selektivt förstärka ASP RNA i CD4 + T-celler som härrör från individer infekterade med HIV-1. Vår metod är relativt låg kostnad, enkel att utföra, mycket tillförlitlig, och enkelt reproducerbara. I detta avseende är det ett kraftfullt verktyg för studiet av antisense transkription inte bara i HIV-1 utan även i andra biologiska system.
Introduction
Den antisense protein (ASP) genen är en öppen läsbild (ORF) ligger på den negativa del av humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) kuvert (ENV) gen, som spänner över korsningen gp120/gp411. Under de senaste 30 åren har flera rapporter visat att hiv ASP-genen verkligen transkriberas och översätts2,3,4,5,6,7,8,9. Även om ASP antisense-transkriptioner har präglats fullt ut in vitro, tills nyligen information om den faktiska produktionen av ASP RNA hos patienter saknades fortfarande.
Sekvensen av ASP är omvänd och kompletterar ENV. Detta är ett stort hinder när du försöker identifiera utskrifter för ASP. Standard metoden omvänd Transkription-polymeras kedjereaktion (RT-PCR) använder genspecifika antisense primers för att syntetisera kompletterande DNAs (cDNAs) av rätt polaritet. Detta tillvägagångssätt, dock inte tillåter att bestämma orientering (mening eller antisense) av den initiala RNA-mall, eftersom RNA hårnålar eller loopar kan Prime RT i båda riktningarna i avsaknad av primers10, ett fenomen som kallas RT Self-priming. De flesta ASP utredare kringgå problemet med RT Self-priming med primers märkta med sekvenser som inte är relaterade till hiv-111,12. Denna strategi eliminerar dock inte uppkomsten av fenomenet, och kan leda till potentiell överföring av icke-specifik cDNAs till PCR11.
Vi har nyligen utvecklat en ny strand-specifik RT-PCR-analys för studiet av antisense RNA och vi har använt det för ASP RNA detektion i en kohort av sex HIV-infekterade patienter, som visas i tabell 1. Det förfarande som beskrivs nedan har tidigare publicerats av Antonio Mancarella et al.13. I vårt protokoll undviker vi att produktionen av icke-specifika cDNAs med en dubbel metod. För det första eliminerar vi RNA sekundära strukturer genom denaturering RNA vid hög temperatur (94 ° c), och för det andra, vi omvänd transkribera ASP RNA med hjälp av en en ASP-specifik primer och affinitet-rena den resulterande cDNA. Genom detta tillvägagångssätt kan vi förstärka endast vårt mål cDNA, eftersom andra icke-specifika RT produkter antingen hindras från att genereras (hög temperatur denaturering av RNA) eller elimineras före PCR (affinitetsrening).
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna rapport beskriver vi en strand-specifik RT-analys tillämpas för detektion av ASP-RNA i CD4 + T-celler isolerade från individer infekterade med HIV-1. Förekomsten av icke-specifik grundning under RT hämmar detekteringen av RNA-utskrifter med rätt polaritet, vilket leder till feltolkning av resultaten. Tidigare grupper har utvecklat flera strategier som syftar till att förebygga primer-oberoende cDNA-syntes under RT-reaktionen. Tagga omvänd primer vid 3 ‘ med sekvenser som inte är relaterade till hiv har v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick och Matthieu Perreau för att alltid vara tillgänglig för att diskutera vårt arbete och alla människor i laboratoriet för AIDS Immunopathogenes för deras dyrbara tekniskt bistånd. Vi skulle också vilja tacka John och Aaron Weddle från VSB Associated Inc. som bidrog med utmärkt konstverk. Slutligen, många speciella tack till alla patienter, utan vilka detta arbete inte skulle ha varit möjligt. Detta arbete fick inget särskilt bidrag från någon finansierings myndighet.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
References
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
- Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
- Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
- Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
- Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
- Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
- Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
- Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
- Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
- Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
- Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
- Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
- Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
- Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
- Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
- Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).
