İplik Spesifik RT-PCR ile Hastalarda İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transkriptlerinin Saptanması
Summary
RNA saç tokaları ve döngüler, sekansa özgü astarların yokluğunda ters transkripsiyon (RT) için astar işlevi görebilir ve üst üste gelen antisense transkriptlerin incelenmesine müdahale eder. İplik spesifik RNA’yı tanımlayabilen bir teknik geliştirdik ve bunu HIV-1 antisense protein ASP’yi incelemek için kullandık.
Abstract
Retrovirüslerde antisense transkripsiyon hem insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) hem de insan T-lenfotropik virüs 1 (HTLV-1) olarak tanımlanmıştır. HIV-1’de antisense protein ASP geni env’nin negatif iplikçiküzerinde, -2 okuma çerçevesinde gp120/gp41 kavşaklarını kapsayan bir proteinde bulunur. Asp açık okuma çerçevesinin 3′ ucu gp120 hiperdeğişken bölgeler V4 ve V5 ile örtüşmektedir. ASP RNA çalışması RT-self-priming olarak bilinen bir fenomen tarafından engellenmiştir, rna ikincil yapılar belirli astar yokluğunda RT asal yeteneğine sahip, spesifik olmayan CD’ler üreten. RT reaksiyonunda biyotinylated ters astarlar ile yüksek RNA denatürasyonu kombine kullanımı, streptavidin kaplı manyetik boncuküzerine cDNA afinite ile birlikte, bize seçici OLARAK CD4 ASP RNA yükseltmek için izin verdi + T hücreleri HIV-1 ile enfekte bireylerden türetilen. Yöntemimiz nispeten düşük maliyetli, gerçekleştirmek için basit, son derece güvenilir ve kolayca tekrarlanabilir. Bu bağlamda, sadece HIV-1’de değil, diğer biyolojik sistemlerde de antisense transkripsiyon çalışması için güçlü bir araçtır.
Introduction
Antisense protein (ASP) geni, insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) zarf (env) geninin negatif iplikçik üzerinde bulunan açık okuma çerçevesi (ORF) olup, gp120/gp411kavşağına yayılan bir gendir. Son 30 yıl içinde, çeşitli raporlar HIV ASP geni gerçekten transkripsiyonu ve tercüme olduğunu göstermiştir2,3,4,5,6,7,8,9. ASP antisense transkriptler tamamen in vitrokarakterize olmasına rağmen , yakın zamana kadar hastalarda ASP RNA gerçek üretimi hakkında bilgi hala eksikti.
ASP dizisi ters ve env tamamlayıcıdır. Bu, ASP transkriptlerini algılamaya çalışırken büyük bir engel teşkil eder. Standart ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemleri, doğru polaritenin tamamlayıcı NA’larını (cDNA’ları) sentezlemek için genlere özgü antisense astarlar kullanır. Ancak bu yaklaşım, rna saç tokaları veya döngüleri10astar yokluğunda her iki yönde de RT asal olabilir, rt kendini astar olarak bilinen bir fenomen, ilk RNA şablonunun yönünü (anlamda veya antisense) belirlemek için izin vermez. Çoğu ASP araştırmacıları HIV-111,12ile ilgili olmayan dizileri ile etiketlenmiş astarlar kullanarak RT kendini astar sorunu kenara . Ancak bu strateji, fenomenin oluşumunu ortadan kaldırmaz ve PCR11’espesifik olmayan CDNA’ların potansiyel olarak taşınmasına yol açabilir.
Yakın zamanda antisense RNA çalışması için yeni bir iplikçik özgü RT-PCR tayini geliştirdik ve Tablo 1’degösterildiği gibi, altı HIV enfekte hastanın bir kohort ASP RNA tespiti için kullandık. Aşağıda açıklanan prosedür daha önce Antonio Mancarella ve ark.13tarafından yayınlanmıştır. Protokolümüzde, spesifik olmayan CNA’ların çift yaklaşımla üretiminden kaçınıyoruz. İlk olarak, RNA’yı yüksek sıcaklıkta (94 °C) reddederek RNA ikincil yapılarını ortadan kaldırıyoruz ve ikinci olarak, biyotinylated ASP’ye özgü astar kullanarak ASP RNA’yı tersine çeviriyoruz ve elde edilen cDNA’yı arındırıyoruz. Bu yaklaşımla, spesifik olmayan diğer RT ürünlerinin üretilmesi (RNA’nın yüksek sıcaklık denatürasyonu) engellenmesi veya PCR (afinite arınma) öncesinde ortadan kaldırılması önlendiği için, sadece hedef cDNA’mızı yükseltebiliriz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, HIV-1 ile enfekte olan bireylerden izole cd4+ T hücrelerinde ASP RNA tespitine uygulanan iplikçik spesifik RT tayini açıklanmıştır. RT sırasında spesifik olmayan astar oluşumu, RNA transkriptlerinin doğru polarite ile saptanmasını engelleyerek sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açtı. Önceki gruplar RT reaksiyonu sırasında astar-bağımsız cDNA sentezini önlemeye yönelik çeşitli stratejiler geliştirmişlerdir. HIV ile ilgili olmayan dizileri ile 3 ‘sonunda ters astar etiketleme i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick ve Matthieu Perreau her zaman bizim çalışma ve AIDS İmmünopatogenez Laboratuvarı’nda tüm insanlar değerli teknik yardım için tartışmak için kullanılabilir olduğu için teşekkür ederiz. Biz de John ve Aaron Weddle VSB Associated Inc kim mükemmel sanat ile katkıda teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, tüm hastalara çok özel teşekkürler, onsuz bu çalışma mümkün olmazdı. Bu çalışma herhangi bir finansman ajansı ndan özel bir hibe almadı.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
References
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
- Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
- Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
- Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
- Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
- Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
- Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
- Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
- Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
- Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
- Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
- Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
- Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
- Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
- Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
- Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).
