Summary

Studio della breve pubblicità peptide sulla soluzione Dispersi Nanoparticelle inorganiche

Published: April 11, 2020
doi:

Summary

Il primo passo nella comprensione dell’interazione tra biomolecola e fase solida inorganica sta rivelando costanti fisico che possono essere valutate stabilendo isotermim di adsorbidimento. L’assorbemento dalla fase liquida è limitato da cinetica, capacità superficiale, pH e adsorbimento competitivo, che tutti dovrebbero essere considerati con cautela prima di impostare un esperimento di adsorbimento.

Abstract

I fondamenti delle interazioni inorganico-organiche sono di fondamentale importanza nella scoperta e nello sviluppo di nuovi biointerfaccia adatti all’utilizzo nella biotecnologia e nella medicina. Studi recenti indicano che le proteine interagiscono con le superfici attraverso siti di adsorbizione limitati. Frammenti proteici come aminoacidi e peptidi possono essere utilizzati per la modellazione dell’interazione tra macromolecole biologiche complesse e superfici inorganiche. Nel corso degli ultimi tre decenni, sono stati sviluppati molti metodi validi e sensibili per misurare i fondamentali della chimica fisica di tali interazioni: calorimetria isotermica di titore (ITC), risonanza del plasmone superficiale (SPR), microbilanciamento del cristallo di quarzo (QCM), fluescenza di riflessione interna totale (TIRF) e spettroscopia di riflessione totale attenuata (ATR).

La tecnica più semplice e conveniente per la misurazione dell’adsorption è il metodo di deplezione, in cui il cambiamento nella concentrazione di sorbate (esaurimento) dopo il contatto con il sorbente disperso nella soluzione viene calcolato e considerato adsorbito. Gli isotermi di adsordimento basati sui dati di esaurimento forniscono tutti i dati fisici di base. Tuttavia, l’adsorbimento da soluzioni richiede tempi di equilibratura più lunghi a causa di restrizioni cinetiche e sorbenti con un’area di superficie elevata specifica, rendendola quasi inapplicabile alle superfici piane fisse macroscopiche. Inoltre, fattori come l’instabilità dei sol, gli aggregati di nanoparticelle, la cristallinità sorbente, la distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle, il pH della soluzione e la concorrenza per l’adsorpazione, dovrebbero essere considerati durante lo studio dei peptidi. La costruzione isotermica dei dati di esaurimento fornisce dati chimici fisici completi per letteralmente ogni sorbate solubile, ma rimane la metodologia più accessibile, in quanto non richiede configurazioni costose. Questo articolo descrive un protocollo di base per lo studio sperimentale dell’adsorbimento dei peptidi sull’ossido inorganico e copre tutti i punti critici che influenzano il processo.

Introduction

Negli ultimi 50 anni l’interazione tra superfici inorganiche e peptidi ha attirato molta attenzione a causa della sua grande importanza nella scienza dei materiali e nella medicina. La ricerca biomedica si concentra sulla compatibilità e la stabilità delle superfici bioinorganiche, che hanno implicazioni dirette per la medicina rigenerativa, l’ingegneria tissutale1,2,3e l’impianto4,5,6,7.7 I dispositivi bioreattivi contemporanei, come sensori e attuatori, si basano su proteine funzionali immobilizzate su superfici semiconduttori di ossido8,9,10,11,12,13. Le moderne pratiche di purificazione per la produzione di proteine spesso si basano sulle proprietà di interazione delle biomolecole nella purificazione e separazione a valle14.

Tra i molteplici ossidi inorganici, il biossido di titanio rimane il più utilizzato in combinazione con substrati biologicamente rilevanti15,16. La ricerca nel settore delle biointerfacce basate su TiO2si è concentrata sulla creazione di un legame forte e specifico di proteine e peptidi senza modificarne le proprietà biologiche e strutturali. In definitiva, l’obiettivo principale è uno strato ad alta densità superficiale di biomolecole con alta stabilità e una maggiore funzionalità che faranno progredire la creazione di applicazioni biotecnologiche e mediche a base di titanio17.

Il titanio e le sue leghe sono stati ampiamente utilizzati come materiale protesico chirurgico per almeno sei decenni perché uno strato di superficie TiO2 con uno spessore di pochi nanometri è resistente alla corrosione e presenta un alto livello di biocompatibilità in molte applicazioni in vivo18,19,20. Il biossido di titanio è anche ampiamente considerato un substrato inorganico prodotto in biomineralizzazione, dove la nucleazione e la crescita in fase inorganica accompagnata da proteine e peptidi possono fornire materiali con promettenti proprietà catalitiche e ottiche21,22,23,24.

Data l’elevata rilevanza dell’interazione tra materiali inorganici e biomolecole in generale e interazioni proteina-TiO2 in particolare, sono state registrate molte ricerche per affrontare la manipolazione e il controllo dell’adsorto delle proteine su TiO2. A causa di questi studi, sono state rivelate alcune proprietà fondamentali di questa interazione, come la cinetica adsorbiente, la copertura superficiale e la conformazione di biomolecola, dando un supporto sostanziale per ulteriori progressi nelle biointerfacce5,13.

Tuttavia, la complessità delle proteine aggiunge notevoli restrizioni alla piena determinazione e comprensione dell’interazione a livello molecolare di una proteina con le superfici inorganiche. Supponendo che le biomolecole interagiscano con le superfici inorganiche attraverso siti limitati, alcune proteine con strutture note e sequenze di amminoacidi sono state ridotte ai loro componenti-peptidi e aminoacidi-che sono studiati separatamente. Alcuni di questi peptidi hanno dimostrato un’attività significativa, che li rende un soggetto unico di studi di adsorbizione senza la necessità di precedente separazione delle proteine25,26,27,28,29,30.

La caratterizzazione quantitativa dell’adsorbimento dei peptidi su TiO2 o su altre superfici inorganiche può essere realizzata mediante metodi fisici che sono stati adattati specificamente per le biomolecole negli ultimi decenni. Questi metodi includono la calorimetria di titola isotermica (ITC), la risonanza del plasmone superficiale (SPR), il microbilanciamento di cristallo di quarzo (QCM), la fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) e la spettroscopia di riflessità totale attenuata (ATR) attenuata, che consentono il rilevamento della forza di adsorptiontion fornendo dati termodinamici chiave: Legatura costante, energia libera da gibblla, enthalpy e31.

L’adsorbizione delle biomolecole al materiale inorganico può essere realizzato in due modi: 1) ITC e il metodo di esaurimento utilizzare particelle disperse in una soluzione che lega alle superfici macroscopiche fisse; 2) SPR, QCM, TIRF e ATR utilizzano superfici macroscopiche modificate con materiale inorganico, come vetro rivestito in oro o trucioli metallici, cristalli di quarzo, cristalli di solfuro di zinco e chip PMMA, rispettivamente.

La calorimetria di titola isotermica (ITC) è un metodo fisico privo di etichette che misura il calore prodotto o consumato al titolazione di soluzioni o miscele eterogenee. Le cellule calorimetriche sensibili rilevano effetti di calore fino a 100 nanojoule, rendendo possibile la misurazione del calore di adsorbinte sulle superfici delle nanoparticelle. Il comportamento termico del sorbate durante l’addizione continua, fornisce un profilo termodinamico completo dell’interazione rivelando l’enthalpy, la costante di legame e l’entropia ad una determinata temperatura32,33,34,35,36.

La spettroscopia di risonanza del plasmone superficiale (SPR) è una tecnica ottica sensibile alla superficie basata sulla misurazione dell’indice di rifrazione del supporto in prossimità della superficie studiata. Si tratta di un metodo in tempo reale e senza etichette per il monitoraggio di adsorbimento reversibile e spessore strato adsorbito. La costante di rilegatura può essere calcolata in base ai tassi di associazione e di dissociazione. Gli esperimenti di adsordimento effettuati a temperature diverse possono fornire informazioni sulla dipendenza dalla temperatura dell’energia di attivazione e in sequenza altri parametri termodinamici37,38,39.

Il metodo QCM (Quarzo Crystal Microbalance) misura il cambiamento della frequenza oscillante dei cristalli piezoelettrici durante i processi di adsorbimento e desorption. La costante di associazione può essere valutata dal rapporto tra le costanti del tasso di adsorption e desorption. QCM viene utilizzato per misurazioni di massa relative e pertanto non ha bisogno di calibrazione25,27,40. QCM viene utilizzato per l’adsorbimento da gas e liquido. La tecnica liquida permette a QCM di essere utilizzata come strumento di analisi per descrivere la deposizione su superfici variamente modificate41.

La fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) è una tecnica ottica ottica delicata basata sulla misurazione della fluorescenza dei fluorofori ad assorbimento eccitata con onde evanescenti riflesse internamente. Il metodo consente il rilevamento di molecole fluorescenti che coprono la superficie con spessori nell’ordine di decine di nanometri, motivo per cui viene utilizzato nello studio dell’adsorbizione macromolecolare su varie superfici42,43. Il monitoraggio in situ delle dinamiche di fluorescenza su adsorption e desorption forniscono la cinetica adsorbiente e quindi i dati termodinamici42,43.

La riflettanza totale attenuata (ATR) è stata utilizzata da Roddick-Lanzilotta per stabilire gli isotermi di adsorbizione lisina basati sulle bande spettrali di lisina a 1.600 e 1.525 cm-1. Questa è la prima volta che la costante di legame per un peptide su TiO2 è stata determinata utilizzando un metodo infrarosso in situ44. Questa tecnica è stata efficace nello stabilire gli isotermi per i peptidi di polilisina45 e gli amminoacidi acidi46.

A differenza dei metodi di cui sopra, dove il parametro di adsorption è misurato in situ, in un esperimento convenzionale la quantità di biomolecole adsorbite viene misurata dal cambiamento di concentrazione dopo che la superficie ha contattato la soluzione. Poiché la concentrazione di un sorbate decade in una stragrande maggioranza dei casi di adsorption, questo metodo è indicato come il metodo di esaurimento. Le misurazioni della concentrazione richiedono un saggio analitico convalidato, che può essere basato su una proprietà analitica intrinseca del sorbate o basato sull’etichettatura47,48,49,50 o derivazione51,52 dello stesso.

Gli esperimenti di adsorbimenti con QCM, SPR, TIRF o ATR richiedono una speciale preparazione superficiale dei chip e dei sensori utilizzati per gli studi di adsorbimenti. Le superfici preparate devono essere utilizzate una sola volta e richiedono un cambiamento al momento del passaggio dell’adsorbate, a causa dell’inevitabile idratazione della superficie di ossido o dell’eventuale chemisorption di un sorbate. È possibile eseguire un solo campione alla volta utilizzando ITC, QCM, SPR, TIRF o ATR, mentre nel metodo di esaurimento è possibile eseguire decine di campioni, per i quali la quantità è limitata solo dalla capacità del termostato e dalla disponibilità del termostato. Ciò è particolarmente importante quando si elaborano grandi lotti di campioni o librerie di molecole bioattive. È importante sottolineare che il metodo di esaurimento non richiede attrezzature costose, ma solo un termostato.

Tuttavia, nonostante i suoi evidenti vantaggi, il metodo di deplezione richiede caratteristiche procedurali complesse che possono sembrare ingombranti. Questo articolo presenta come eseguire uno studio fisico completo di pubblicità dipeptide su TiO2 utilizzando il metodo di esaurimento e affronta i problemi che i ricercatori possono affrontare quando eseguono esperimenti pertinenti.

Protocol

1. Preparazione di soluzioni e diluizioni di dissidi Preparazione della soluzione dipeptide da 16 mM Mettere 0,183 g di un dipeptide (Ile-His) (vedi Tabella dei Materiali)in una provetta polimerica sterile, diluire a 35 mL con acqua a doppia distillazione (DDW) e sciogliere a temperatura ambiente (RT) con agitazione vigorosa.NOTA: Se il dipeptide non si dissolve in DDW mentre si agita, mettere la soluzione dipeptide in un bagno ad ultrasuoni e sonicare per alcuni minuti. …

Representative Results

L’adsorbimento di un dipeptide sul biossido di titanio nanocristalliè è stato studiato in condizioni biocompatibili in un intervallo di temperatura di 0-40 gradi centigradi. L’adsorption sperimentale di dipeptide (A, mmol/g) sulla superficie di un biossido di titanio è stato valutato come Dove C0 …

Discussion

L’adsorbimento da soluzioni per la costruzione di isotermi richiede un tempo più lungo equilibrato per il tempo equilibrato a causa di restrizioni cinetiche e sorbenti con un’alta superficie specifica. Inoltre, l’instabilità dei sol, gli aggregati di nanoparticelle, la cristallinità, la distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle, il pH della soluzione e la concorrenza per l’assorbimento dovrebbero essere considerati durante l’assorbimento degli amminoacidi. Tuttavia, adsorgendo costruzione isoterma utilizzand…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Fondazione russa per la ricerca di base (Grant no.

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid TCI Chemicals 4432-31-9 MES, >98%
Acetonitrile Panreac AppliChem HPLC grade
Chromatography vials glass
Dipeptide Ile-His Bachem 4000894
Double-distilled water DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" J.P. Selecta 3000865 5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector Shimadzu, LC-20 Prominence HPLC
Isopropanol Sigma-Aldrich (Merck) 67-63-0 99.70%
LabSolutions Lite Shimadzu 223-60410 Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2 Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate Acros Organics 103-72-0 PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column ZORBAX LC 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter Vladfilter 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube polypropylene
Thermostat TC-502 Brookfield Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine Sigma-Aldrich (Merck) 121-44-8 TEA; 99%
Trifluoroacetic acid Panreac AppliChem 163317 TFA, 99%

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