الخطوة الأولى في فهم التفاعل المرحلة الصلبة اللاعضوية الجزيء الحيوي هو الكشف عن الثوابت الكيميائية الفيزيائية الأساسية التي يمكن تقييمها عن طريق إنشاء isotherms الامتزاز. يتم تقييد الامتزاز من المرحلة السائلة بواسطة الحركية ، والقدرة السطحية ، ودرجة الحموضة ، والامتزاز التنافسي ، والتي يجب النظر فيها جميعًا بحذر قبل وضع تجربة الامتزاز.
وتتسم أساسيات التفاعلات غير العضوية العضوية بأهمية حاسمة في اكتشاف وتطوير واجهات بيولوجية جديدة قابلة للاستخدام في التكنولوجيا الأحيائية والطب. تشير الدراسات الحديثة إلى أن البروتينات تتفاعل مع الأسطح من خلال مواقع الامتزاز المحدودة. يمكن استخدام شظايا البروتين مثل الأحماض الأمينية والببتيدات للتفاعل بين الجزيئات البيولوجية المعقدة والأسطح غير العضوية. خلال العقود الثلاثة الماضية، تم تطوير العديد من الأساليب الصالحة والحساسة لقياس أساسيات الكيمياء الفيزيائية لتلك التفاعلات: قياس السعرات الحرارية (ITC)، والرنين السطحي البلازمون (SPR)، والكوارتز الكريستال microbalance (QCM)، وتوازن الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF)، والطيف الطيفي الكلي المبطين (ATR).
وأبسط التقنيات وأكثرها يسراً لقياس الامتزاز هي طريقة الاستنفاد، حيث يتم حساب التغير في تركيز سوربات (الاستنفاد) بعد ملامسة المواد الماصة المتناثرة في المحلول ويفترض أن تكون ممتزة. توفر ممتزات الامتصاص المستندة إلى بيانات الاستنفاد جميع البيانات الفيزيائية الكيميائية الأساسية. ومع ذلك، يتطلب الامتزاز من الحلول أوقات توازن أطول بسبب القيود الحركية والمواد الماصة مع مساحة سطح محددة عالية، مما يجعلها غير قابلة للتطبيق تقريبًا على أسطح الطائرة الثابتة العيانية. وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر في عوامل مثل عدم استقرار السول، مجاميع الجسيمات النانوية، والبلورية الماصة، وتوزيع حجم الجسيمات النانوية، ودرجة الحموضة للحل، والمنافسة على الامتزاز، أثناء دراسة الببتيدات الممتزة. استنفاد البيانات isotherm البناء يوفر بيانات الكيمياء الفيزيائية الشاملة لكل sorbate القابلة للذوبان حرفيا حتى الآن لا يزال المنهجية الأكثر سهولة، كما أنها لا تتطلب الاجهزة باهظة الثمن. تصف هذه المقالة بروتوكولًا أساسيًا للدراسة التجريبية لممتزاز الببتيد على أكسيد غير عضوي وتغطي جميع النقاط الحرجة التي تؤثر على العملية.
على مدى السنوات ال 50 الماضية جذب التفاعل بين الأسطح غير العضوية والببتيدات الكثير من الاهتمام بسبب أهميته العالية في علم المواد والطب. تركز البحوث الطبية الحيوية على توافق واستقرار الأسطح العضوية الحيوية ، والتي لها آثار مباشرة على الطب التجديدي ، وهندسة الأنسجة1،2،3، والزرع4،5،6،7. تعتمد الأجهزة المعاصرة المستجيبة بيولوجياً، مثل أجهزة الاستشعار والأكتورات، على بروتينات وظيفية معطلة على أسطح أشباه أكسيد8،9،10،11،12،13. غالبًا ما تعتمد ممارسات التنقية الحديثة لإنتاج البروتين على خصائص تفاعل الجزيئات الحيوية في تنقية المصب وفصلها14.
من بين أكاسيد غير عضوية متعددة ، لا يزال ثاني أكسيد التيتانيوم الأكثر استخدامًا في تركيبة مع ركائز ذات صلة بيولوجيًا15،16. وقد ركزت البحوث في مجال TiO2القائم على الواجهات الحيوية على إنشاء ربط قوي ومحدد من البروتينات والببتيدات دون تغيير خصائصها البيولوجية والهيكلية. في نهاية المطاف ، فإن الهدف الرئيسي هو طبقة عالية الكثافة السطحية من الجزيئات الحيوية مع استقرار عال وزيادة الوظائف التي من شأنها أن تقدم إنشاء التطبيقات الحيوية القائمة على التيتانيوم والتكنولوجيا الحيوية والطبية17.
وقد استخدمت التيتانيوم وسبائكها على نطاق واسع كمادة زرع الجراحية لمدة ستة عقود على الأقل لأن طبقة TiO2 سطح مع سمك بضعة نانومتر مقاومة للتآكل والمعارض مستوى عال من التوافق البيولوجي في العديد من التطبيقات في الجسم الحي18،19،20. ثاني أكسيد التيتانيوم يعتبر أيضا على نطاق واسع الركيزة غير العضوية المنتجة في التعدين الحيوي، حيث النواة ونمو المرحلة غير العضوية يرافقه البروتينات والببتيدات قد توفر المواد مع خصائص الحفاز والبصرية واعدة21،,22،,23،,24.
نظرا ً للأهمية العالية للتفاعل بين المواد غير العضوية والجزيئات الحيوية بشكل عام وتفاعلات البروتين-TiO2 بشكل خاص ، كان هناك الكثير من الأبحاث لمعالجة التلاعب والسيطرة على امتصاص البروتينات على TiO2. بسبب هذه الدراسات، تم الكشف عن بعض الخصائص الأساسية لهذا التفاعل، مثل حركية الامتزاز، والتغطية السطحية، والتوافق الجزيء الحيوي، مما يعطي دعما كبيرا لمزيد من التقدم في الواجهات الحيوية5،13.
ومع ذلك، يضيف تعقيد البروتين قيودًا كبيرة على التحديد والفهم الكاملين للتفاعل على المستوى الجزيئي للبروتين مع الأسطح غير العضوية. على افتراض أن الجزيئات الحيوية تتفاعل مع الأسطح غير العضوية من خلال مواقع محدودة ، تم تقليل بعض البروتينات ذات الهياكل المعروفة وتسلسل الأحماض الأمينية إلى مكوناتها – الببتيدات والأحماض الأمينية – التي تتم دراستها بشكل منفصل. وقد أظهرت بعض هذه الببتيدات نشاط كبير، مما يجعلها موضوعا فريدا من الدراسات الامتزاز دون الحاجة إلى فصل البروتين السابق25،,26،27،,28،,29،,30.,
يمكن تحقيق التوصيف الكمي لالامتزاز الببتيد على TiO2 أو الأسطح غير العضوية الأخرى عن طريق الطرق الفيزيائية التي تم تكييفها خصيصًا للجزيئات الحيوية على مدى العقود القليلة الماضية. وتشمل هذه الأساليب قياس السعرات الحرارية المعايرة isothermal (ITC)، وصدى البلازمون السطحي (SPR)، والكوارتز الكريستال microbalance (QCM)، ومضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF)، ومطياف الانعكاس الكلي المخفف (ATR)، وكلها تسمح بالكشف عن قوة الامتزاز من خلال توفير البيانات الحرارية الرئيسية: ثابت ملزم، جيبس الطاقة الحرة، enthalpy، وentropy31.
ويمكن أن يتم امتصاص الجزيئات الحيوية للمواد غير العضوية بطريقتين: 1) مركز الـITC وكذلك طريقة استنفاد استخدام الجسيمات المنتشرة في محلول ملزم للأسطح العيانية الثابتة؛ (2) استخدام الجسيمات المنتشرين في محلول ملزم للأسطح العيانية الثابتة. 2) SPR، QCM، TIRF، وATR استخدام الأسطح العيانية المعدلة مع المواد غير العضوية، مثل الزجاج المغلفة بالذهب أو رقائق معدنية، بلورات الكوارتز، بلورات كبريتيد الزنك، ورقائق PMMA، على التوالي.
قياس السعرات الحرارية (ITC) هو أسلوب مادي خال ٍ من العلامات يقيس الحرارة المنتجة أو المستهلكة عند معايرة المحاليل أو الخلائط غير المتجانسة. تكشف الخلايا الحرارية الحساسة عن تأثيرات حرارية صغيرة مثل 100 نانوجول ، مما يجعل قياس حرارة الامتزاز على أسطح الجسيمات النانوية ممكنًا. السلوك الحراري للسوربات أثناء الإضافة المستمرة – المعايرة ، ويوفر لمحة ديناميكية حرارية كاملة عن التفاعل الذي يكشف عن enthalpy ، ثابت ملزم ، وإنتروبيا في درجة حرارة معينة32،33،34،35،36.
التحليل الطيفي لصدى البلازمون السطحي (SPR) هو تقنية بصرية حساسة للسطح تعتمد على قياس مؤشر الانكسار لوسائل الإعلام على مقربة من السطح المدروس. بل هو وسيلة في الوقت الحقيقي وخالية من التسمية لرصد الامتزاز عكسها وسمك طبقة مالامتداد. يمكن حساب ثابت الربط من معدلات الاقتران والتفكك. قد توفر تجارب الامتزاز التي يتم إجراؤها في درجات حرارة مختلفة معلومات حول اعتماد درجة الحرارة على طاقة التنشيط والمعلمات الحرارية الأخرى بشكل متسلسل37،38،39.
تقيس طريقة الكوارتز الكريستالي (QCM) التغير في التردد المتذبذب للبلورات الكهربية الكهربية خلال عمليات الامتزاز والامتزاز. يمكن تقييم ثابت الربط من نسبة ثوابت معدل الامتزاز والامتزاز. يتم استخدام QCM لقياسات الكتلة النسبية ، وبالتالي ، لا يحتاج إلى معايرة25،27،40. يستخدم QCM للامتزاز من كل من الغاز والسائل. تسمح تقنية السائل استخدام QCM كأداة تحليل لوصف الترسيب على الأسطح المعدلة بشكل مختلف41.
مجموع التفلور الانعكاس الداخلي (TIRF) هو تقنية حساسة بين الوجه البصرية على أساس قياس الفلورسCence من الفلوروبورهورس اتسهات مع موجات إيفانسية تنعكس داخليا. تسمح هذه الطريقة بالكشف عن جزيئات الفلورسنت التي تغطي السطح بسماكات على ترتيب عشرات النانومترات ، وهذا هو السبب في أنها تستخدم في دراسة الامتزاز الجزيئي الكلي على مختلف الأسطح42،43. في رصد الموقع من ديناميات الفلورسينس على الامتزاز والامتزاز توفير حركية الامتزاز وبالتالي البيانات الحرارية42،43.
تم استخدام الانعكاس الكلي المتيني (ATR) من قبل روديك-Lanzilotta لإنشاء isotherms امتصاص الليسين على أساس النطاقات الطيفية الليسين في 1,600 و 1,525 سم-1. هذه هي المرة الأولى التي تم تحديد ثابت ملزم للببتيد على TiO2 باستخدام طريقة الأشعة تحت الحمراء في الموقع44. كانت هذه التقنية فعالة في إنشاء isotherms الامتزاز لببتيدات البوليليسين45 والأحماض الأمينية الحمضية46.
على عكس الطرق المذكورة أعلاه ، حيث يتم قياس معلمة الامتزاز في الموقع ، في تجربة تقليدية يتم قياس كمية الجزيئات الحيوية الممتزة عن طريق تغيير التركيز بعد اتصال السطح بالحل. لأن تركيز سوربات يتحلل في الغالبية العظمى من حالات الامتزاز ، ويشار إلى هذه الطريقة على أنها طريقة الاستنفاد. تتطلب قياسات التركيز مسحتحليلي مصدق عليه ، والذي قد يستند إلى خاصية تحليلية جوهرية للسوربات أو استنادًا إلى وضع العلامات47،48،4949،50 أو اشتقاق51،52 منه.
تتطلب تجارب الامتزاز باستخدام QCM أو SPR أو TIRF أو ATR إعداد سطح خاص للرقائق وأجهزة الاستشعار المستخدمة في دراسات الامتزاز. يجب استخدام الأسطح المعدة مرة واحدة وتتطلب التغيير عند تبديل الممتز ، بسبب الترطيب الحتمي لسطح أكسيد أو الترويسوربتيا يمكن أن يكون من سوربات. ويمكن تشغيل عينة واحدة فقط في كل مرة باستخدام مركز الـITC أو QCM أو SPR أو TIRF أو ATR، في حين أنه في طريقة الاستنفاد يمكن للمرء أن يدير عشرات العينات، التي تقتصر الكمية عليها فقط على سعة ترمساست التربة وتوافر المواد الماصة. وهذا مهم بشكل خاص عند معالجة دفعات عينة كبيرة أو مكتبات من الجزيئات النشطة بيولوجيا. والأهم من ذلك أن طريقة الاستنفاد لا تتطلب معدات مكلفة بل تتطلب فقط جهاز اعادة الرموست.
ومع ذلك، وعلى الرغم من مزاياها الواضحة، فإن طريقة الاستنفاد تتطلب سمات إجرائية معقدة قد تبدو مرهقة. تعرض هذه المقالة كيفية إجراء دراسة فيزيائية كيميائية شاملة لالامتزاز dipeptide على TiO2 باستخدام طريقة الاستنفاد وتتناول القضايا التي قد يواجهها الباحثون عند إجراء التجارب ذات الصلة.
يتطلب الامتصاص من حلول بناء isotherm وقتًا أطول للتوازن بسبب القيود الحركية والمواد الماصة ذات مساحة سطح محددة عالية. وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر في عدم استقرار sols، ومجاميع الجسيمات النانوية، والبلورية، وتوزيع حجم الجسيمات النانوية، ودرجة الحموضة للحل، والمنافسة على الامتزاز أثناء امتصاص ?…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل ماليا المؤسسة الروسية للبحوث الأساسية (المنحة رقم 15-03-07834-أ).
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | TCI Chemicals | 4432-31-9 | MES, >98% |
Acetonitrile | Panreac AppliChem | HPLC grade | |
Chromatography vials | glass | ||
Dipeptide Ile-His | Bachem | 4000894 | |
Double-distilled water | DDW was obtained on spot | ||
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" | J.P. Selecta | 3000865 | 5 L, 40 kHz, 120 Watts |
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector | Shimadzu, LC-20 Prominence | HPLC | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich (Merck) | 67-63-0 | 99.70% |
LabSolutions Lite | Shimadzu | 223-60410 | Software for high-performance liquid chromatography system |
Nanocrystalline TiO2 | Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details. | ||
Phenyl isothiocyanate | Acros Organics | 103-72-0 | PITC, 98% |
Reversed-phase Zorbax column | ZORBAX LC | 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm | |
Syringe filter | Vladfilter | 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate | |
Test sterile polymeric tube | polypropylene | ||
Thermostat TC-502 | Brookfield | Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich (Merck) | 121-44-8 | TEA; 99% |
Trifluoroacetic acid | Panreac AppliChem | 163317 | TFA, 99% |