초파리 날개 디스크에서 이미징 Dpp 릴리스
Summary
리간드에 노출되는 타이밍은 발달 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서 우리는 날개 디스크의 세포에서 Dpp에게 불린 Drosophila 뼈 형태 유전학 단백질 (BMP)의 심상 방출을 보여주는 방법을 보여줍니다.
Abstract
변형 성장 인자 베타 (TGF-β) 슈퍼 패밀리는 다세포 유기체에서 성인 구조의 초기 배아 패터닝 및 발달에 필수적입니다. TGF-β 수퍼패밀리는 TGF-β, 골형태유전학단백질(BMPs), 액티빈, 성장 및 분화 인자, 및 노달을 포함한다. 세포에 노출된 리간드의 양이 그 효과에 중요하다는 것은 오랫동안 알려져 왔다. 장거리 농도 그라데이션이 배아 패턴을 설정한다고 생각되었다. 그러나, 최근에는 이 리간드에 노출되는 타이밍이 그들의 다운스트림 전사 결과에 대해서도 중요하다는 것이 분명해졌다. TGF-β 수퍼패밀리 리간드가 생산된 세포로부터 방출될 때까지 는 발달 결과를 가질 수 없다. 최근까지, 이 리간드가 세포로부터 방출된 시기를 결정하는 것은 어려웠다. 여기에서 우리는 날개 프리모르듐 또는 날개 디스크의 세포에서 Decapentaplegic (Dpp)에게 불린 Drosophila BMP의 방출을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 다른 시스템 또는 시그널링 리간드에 대해 수정될 수 있습니다.
Introduction
뼈 형태 유전학 단백질 (BMP)는 성인 구조물의 초기 배아 발생 및 패터닝에 필수적입니다. BMP는 반응하는 세포에 있는 성장 그리고 세포 분화에 필요한 표적 유전자의 전사에 영향을 미치기 위하여 생성되고 분비됩니다. 데카펜타페지(Dpp)는 BMP4의 초파리 상동체로 날개1,2,3,4와같은 배아 및 성인 구조의 발달에 중요하다. 몇몇 단은 1) 날개가 쉽게 평가될 수 있는 일관된 venation 패턴을 가진 2개의 투명한 상피 시트로 구성되기 때문에 성인 플라이 날개를 패터닝에 있는 Dpp의 역할에 집중했습니다; 2) 날개 디스크는 또한 합리적으로 평평하고, 애벌레 의 외부에서 배양 될 수 있으며, 이미지화하고 패턴의 차이를 정량화하기 쉽습니다; 및 3) 날개 패턴 개발은 Dpp에 민감하여 통로내의 작은 섭동이 날개 venation 패턴에 영향을 미치게 한다.
Dpp는 날개디스크5,6,7,8의전방 /후방 경계에 위치한 세포에서 생산됩니다. Dpp는 타입-1 및 타입-2 세린/스레오닌 키나아제 수용체9,10의복합체에 결합한다. Dpp 결합시, 타입-2 수용체는 그 때 Dpp (Mad), Smad 1/5/8 호몰로그에 대하여 어머니를 인산화하는 타입-1 수용체를 인산화합니다. 인산화된 SMAD는 추가적인 코스마드(Medea)를 모집하여 표적 유전자를 조절하는 핵에 진입할 수 있게 하여 증식 또는분화와같은 하류 효과로 이어진다4,11.
최근, Bates Lab은 날개 디스크 내에서 Dpp의 부적절한 방출이 광인화의 감소, 표적 유전자 발현의 감소 및 날개 패터닝 결함12,13으로이어질 수 있음을 보여주었다. 몇몇 이온 채널은 Drosophila 날개 및 관련 구조물의 발달에 영향을 미치는14,15. 이러한 이온 채널은 Dpp 릴리스에도 관여할 수 있습니다. 모르포겐 방출의 메커니즘을 결정할 때, 방출 이벤트를 시각화하는 방법이 중요하다.
아우렐리오 텔레만 박사와 스티븐 코헨 박사는 Dpp의 손실을 구출할 수 있는 Dpp-GFP 융합 단백질을 생성했는데, 이는 Dpp가 생물학적으로 활성상태이며 생물학적으로 관련성이 있는 방식으로 방출된다는 것을의미합니다 16. 여기서는 이 Dpp-GFP를 사용하여 Dpp 릴리스 이벤트를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 융합 단백질은 GFP가 산성 소포에 있을 때 형광이담금질되도록pH에 민감하기 때문에 특히 유용하다. 따라서 GFP로 태그가 지정된 단백질이 소포에서 보다 중립적인 세포외 환경으로 방출되면 GFP 형광 강도가17증가합니다. 우리는 Dpp-GFP가 산성 소포에 상주하는지 결정하기 위해 GFP의 pH 감도를 이용했습니다. 우리는 세포 내 구획 소포 소포 를 중화 암모늄 염화물의 추가 전후 Dpp-GFP를 표현하는 날개 디스크를 이미지18. 우리는 암모늄 염화물의 추가 후에 puncta의 형광에 있는 중요한 증가를 찾아냈습니다, 세포내 Dpp-GFP가 염화암모늄18의추가의 앞에 담금질된다는 것을 건의합니다. 우리는 세포내 Dpp-GFP가 소포와 같은 산성 막 경계 구획에 상주하고, 세포내 구획의 pH를 중화하기 위하여 염화암모늄을 첨가시 풀어 두지 된다는 결론을 내립니다18. 이것은 Dpp-GFP의 살아있는 화상 진찰이 세포외 환경으로 산성 구획에서 풀어 놓이기 때문에 Drosophila 날개 디스크에 있는 Dpp의 역학을 구상하는 유용한 기술합니다.
여기서는 Dpp-GFP를 사용하여 Dpp 릴리스 이벤트를 시각화하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. Dpp-GFP는 UAS-GAL4시스템(19)을사용하여 드로소필라 윙 디스크에서 그 기본 패턴으로 표현될 수 있다. 이것은 Irk 채널이 Dpp 릴리스18에영향을 미치는지 확인하는 데 사용된 방법입니다. 우리는 라이브 이미징 z-스택에 의해 방법을 검증했습니다. 한 개의 포커스 평면에서 획득하면 Dpp-GFP puncta가 타임시리즈에서 초점의 평면 내에서 움직이는 것을 볼 수 없습니다. 우리는 또한 우리가 z 스택에 이미지 경우 Dpp-GFP puncta의 움직임을 볼 수 없습니다. 우리는 이 방법을 사용하여 본 Dpp-GFP puncta가 세포 내 소포의 움직임보다는 방출 사건이라고 결론을 내립니다. Dpp-GFP의 라이브 이미징 이 방법은 잠재적으로 Dpp 역학에 미치는 영향에 대한 Dpp 릴리스의 다른 putative 수정자를 테스트하는 데 사용되거나 다른 리간드의 역학을 보기 위해 수정될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dpp와 같은 BMP는 막 결합 수용체의 복합체를 결합하여 이웃 또는 분명히 먼 세포에서 세포 내 신호의 폭포를 일으킬 때 중요한 영향을 미칩니다. 토마스 콘버그 박사의 연구실은세포가 사이톤15,24,25라고불리는 액틴 기반의 얇은 필라포디아 형 구조를 사용하여 신호를 수신하는 Dpp 신호 접촉 세포를 생성하는 것으로 나타났다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜의 이전 버전에서 작업해 주신 사라 프라드한 박사에게 감사드립니다. 우리는 우리가이 프로토콜을 개발하는 동안 자금 NSF-IOS 1354282 감사드립니다. 우리는 현재 우리의 실험실자금을 지원해 준 NIH-NIDCR RO1DE025311에 감사드립니다.
Materials
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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