리간드에 노출되는 타이밍은 발달 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서 우리는 날개 디스크의 세포에서 Dpp에게 불린 Drosophila 뼈 형태 유전학 단백질 (BMP)의 심상 방출을 보여주는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
변형 성장 인자 베타 (TGF-β) 슈퍼 패밀리는 다세포 유기체에서 성인 구조의 초기 배아 패터닝 및 발달에 필수적입니다. TGF-β 수퍼패밀리는 TGF-β, 골형태유전학단백질(BMPs), 액티빈, 성장 및 분화 인자, 및 노달을 포함한다. 세포에 노출된 리간드의 양이 그 효과에 중요하다는 것은 오랫동안 알려져 왔다. 장거리 농도 그라데이션이 배아 패턴을 설정한다고 생각되었다. 그러나, 최근에는 이 리간드에 노출되는 타이밍이 그들의 다운스트림 전사 결과에 대해서도 중요하다는 것이 분명해졌다. TGF-β 수퍼패밀리 리간드가 생산된 세포로부터 방출될 때까지 는 발달 결과를 가질 수 없다. 최근까지, 이 리간드가 세포로부터 방출된 시기를 결정하는 것은 어려웠다. 여기에서 우리는 날개 프리모르듐 또는 날개 디스크의 세포에서 Decapentaplegic (Dpp)에게 불린 Drosophila BMP의 방출을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 다른 시스템 또는 시그널링 리간드에 대해 수정될 수 있습니다.
서론
뼈 형태 유전학 단백질 (BMP)는 성인 구조물의 초기 배아 발생 및 패터닝에 필수적입니다. BMP는 반응하는 세포에 있는 성장 그리고 세포 분화에 필요한 표적 유전자의 전사에 영향을 미치기 위하여 생성되고 분비됩니다. 데카펜타페지(Dpp)는 BMP4의 초파리 상동체로 날개1,2,3,4와같은 배아 및 성인 구조의 발달에 중요하다. 몇몇 단은 1) 날개가 쉽게 평가될 수 있는 일관된 venation 패턴을 가진 2개의 투명한 상피 시트로 구성되기 때문에 성인 플라이 날개를 패터닝에 있는 Dpp의 역할에 집중했습니다; 2) 날개 디스크는 또한 합리적으로 평평하고, 애벌레 의 외부에서 배양 될 수 있으며, 이미지화하고 패턴의 차이를 정량화하기 쉽습니다; 및 3) 날개 패턴 개발은 Dpp에 민감하여 통로내의 작은 섭동이 날개 venation 패턴에 영향을 미치게 한다.
Dpp는 날개디스크5,6,....
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프로토콜
1. 해부를 위해 애벌레를 생성하기 위해 계란을 수집
- 크로스 30-40 처녀 여성 Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu는 10-15 남성 Sp/CyO-GFP로 비행한다; UAS-Dpp-GFP/ TM6 Tb 후.
참고: Dpp-GAL4 및 UAS-Dpp-GFP를 포함하는 임의의 2개의 유전자형은 밸런서가 애벌레 단계 동안 적절한 자손의 선택을 허용하는 애벌레 마커가 있는 한 사용될 수 있다. - 계란을 수집하려면, 교차 된 파리를 음식의 신선한 유리병으로 뒤집어 서 유리병에서 제거하기 전에 3-4 시간 동안 누워있게하십시오. 계란 누워를 장려하기 위해, 소량의 물과 혼합 된 과립 효모로 만든 소량의 효모 페이스트를 파리가 바이알에 도입되기 전에 음식의 상단에 첨가 할 수 있습니다. 동일한 세트의 교차 파리를 보관하고 최대 7 일간 계란 수집에 사용할 수 있습니다.
참고: 모든 표준 초파리 옥수수 가루 음식 조리법은 허용되어야한다. 여기에 헤이즈와 리스20에의해 설명 된 음식 조리법입니다 사용됩니다. - 유충이 세 번째 instar (방황) 단계에 때까지 약 144 시간 동안 25 °C에서 계란 수집 바이알을 유지합니다.
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결과
그림 2는 이 프로토콜의 대표적인 실시간 이미징 결과를 보여줍니다. 프로토콜이 성공하면, Dpp-GFP는 Dpp-GFP 영역 내의 비형광 원으로 보이는 핵을 가진 날개 디스크의 중심 아래로 스트라이프로 볼 수있다(그림 2). Dpp-GFP 방출은 나타나고 사라지는 형광 puncta로 보입니다. 우리는 Dpp-GFP 형광이 세포 체에서 그리고 세포 체에서 멀리 나타나는 것을 관찰했습니다. Dpp 시그널링은세포체(22,23)로부터멀리 연장되는 사이톤메라고 불리는 액틴계 필로포디아 유사 구조에 의존한다. 따라서, 이러한 제시된 비디오에서 Dpp-GFP puncta가 Dpp 생산 세포체로부터 멀리 시각화되는 것은 사이톤또는 사이톤메"시냅스"15에서가능성이 높다. 이러한 puncta는 .......
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토론
Dpp와 같은 BMP는 막 결합 수용체의 복합체를 결합하여 이웃 또는 분명히 먼 세포에서 세포 내 신호의 폭포를 일으킬 때 중요한 영향을 미칩니다. 토마스 콘버그 박사의 연구실은세포가 사이톤15,24,25라고불리는 액틴 기반의 얇은 필라포디아 형 구조를 사용하여 신호를 수신하는 Dpp 신호 접촉 세포를 생성하는 것으로 나타났다. 이들 데이터는 이러한 맥락에서 발달세포-세포 통신이 뉴런시냅스(26)와유사할 수 있음을 시사한다. 시 냅 스 통신에서, 신경 전달 물질 방출의 역학은 후 세포에 미치는 영향에 중요 한. 마찬가지로, Dpp 릴리스의 역학은 다운스트림 결과12에도중요합니다. 따라서, Dpp 방출에 영향을 미치는 요인이 무엇인지 이해하기 위해 상이한 유전적 배경 및 조건에서 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 프로토콜의 이전 버전에서 작업해 주신 사라 프라드한 박사에게 감사드립니다. 우리는 우리가이 프로토콜을 개발하는 동안 자금 NSF-IOS 1354282 감사드립니다. 우리는 현재 우리의 실험실자금을 지원해 준 NIH-NIDCR RO1DE025311에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 빵 효모 | 레드 스타 | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| 양면 테이프 | Scotch | ||
| Drosophila Agari Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | 이 재고는 곧 Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP에서 사용할 수 있습니다. UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | 이 재고는 곧 블루밍턴 초파리 재고 센터에서 사용할 수 | ||
| Dumont 핀셋 #5 | 해부용 세계 | 정밀 기기 | 500233 |
| Sigma Aldrich | H3375 | ||
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| 맥아 추출물 | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| 현미경 슬라이드 | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| 매니큐어 | 전자 현미경 과학 | 72180 | |
| 프로피온산 | VWR | U330-09 | |
| 콩 | ADM 특수 성분 | 062-100 | |
| 자 | 피셔 사이언티픽 | S5-3 | |
| 자당 | 피셔 | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| 트레할로스 이수화물 | Chem-Impex 인터내셔널, Inc. | 00766 | |
| 노란 옥수수 가루 | 퀘이커 | ||
| Zeiss LSM 780 컨포칼 현미경 | 라이브 이미징용 | Zeiss | |
| 현미경 Zeiss SteREO Discovery.V8 현미경 | 부용 | Zeiss |
참고문헌
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V.
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재인쇄 및 허가
