Kvantifiering av tumörcellviddhesion i lymfkörteln Cryosections
Summary
Här beskriver vi en enkel och billig metod som gör det möjligt att kvantifiera självhäftande tumörceller till lymfkörteln (LN) kryosektioner. LN-anhängare tumörceller är lätt identifieras med ljus mikroskopi och bekräftas av en fluorescens-baserad metod, vilket ger en vidhäftning index som avslöjar tumörcell-bindande affinitet till LN parenkym.
Abstract
Tumördränerande lymfkörtlar (LNs) är inte bara filter av tumörproducerat avfall. De är en av de vanligaste regionala platserna för provisorisk bosättning av spridas tumörceller hos patienter med olika typer av cancer. Upptäckten av dessa LN-bosatt tumörceller är en viktig biomarkör i samband med dålig prognos och adjuvant terapi beslut. Senaste musmodeller har indikerat att LN-bosatt tumörceller kan vara en betydande källa till maligna celler för avlägsna metastaser. Förmågan att kvantifiera tumörcellernas vidhäftighet till LN-parenkym är en kritisk mätare i experimentell forskning som fokuserar på identifiering av gener eller signalvägar som är relevanta för lymfatisk/metastaserande spridning. Eftersom LNs är komplexa 3D-strukturer med en mängd olika utseenden och kompositioner i vävnadssektioner beroende på sektionsplanet, är deras matriser svåra att replikera experimentellt in vitro på ett helt kontrollerat sätt. Här beskriver vi en enkel och billig metod som gör det möjligt att kvantifiera självhäftande tumörceller till LN kryosektioner. Med hjälp av seriella delar av samma LN anpassar vi den klassiska metoden som utvecklats av Brodt för att använda icke-radioaktiva etiketter och direkt räkna antalet angränsande tumörceller per LN-yta. LN-anhängare tumörceller identifieras lätt av ljusmikroskopi och bekräftas av en fluorescensbaserad metod, vilket ger en vidhäftning spektion index som avslöjar cell-bindande affinitet till LN parenkyma, vilket är suggestiva bevis på molekylära förändringar i affinitet bindande integrins till deras korrelera LN-ligands.
Introduction
Cancer metastasering är den främsta orsaken till behandlingssvikt och den dominerande livshotande aspekten av cancer. Som postulerade 130 år sedan, den metastaserande spridning resultat när en elit av spridda tumörceller (DTCs, “frön”) förvärva specifika biologiska förmågor som tillåter dem att undvika primära platser och etablera malign tillväxt på avlägsna platser (den “jord”)1. Nyligen har flera nya begrepp om “utsäde och jord” relationer uppstått, såsom induktion av premetastatiska nischer (konceptualiserade som en “bördig jord” som behövs för “frön” att frodas), självsådd av primära tumörer av DTCs, “utsäde” dvala på sekundära organ och parallell progression modell av metastasering2.
För de flesta solida maligniteter kan DTCs vistas och upptäckas i många mesenchymal organ, såsom benmärg och lymfkörtlar (LNs) hos patienter med eller utan bevis på klinisk metastasering. Eftersom tumördränerande LNs är den första platsen för den regionala spridningen av DTCs, är LN status en viktig prognostisk indikator och är ofta förknippad med adjuvant terapi beslut3. För vissa tumörtyper är korrelationen mellan LN-status och sämre resultat stark, inklusive huvud och hals4,5,bröst6,prostata7,lung8,mag9,kolorektal10,11 och sköldkörtelcancer12.
LNs är små ovala organ i det lymfatiska systemet, som är täckta med reticular celler och inneslutna med lymfkärl. Dessa organ är absolut nödvändiga förimmunsystemets funktion 13. LNs fungera som attractant plattformar för immun cirkulerande celler, föra lymfocyter och antigen-presentera celler tillsammans14. LNs lockar dock också cirkulerande tumörceller. Under årtionden var LNs avbildas som passiva transportvägar för metastaserande tumörceller. Emellertid, nyligen genomförda studier har visat att tumörceller kan också styras mot LNs av kemotaktiska (kemokiner) och / eller haptotactic (extracellulära matriselement) ledtrådar utsöndras av lymfatisk endothelium15. Som exempel, överuttryck av CCR7-receptorn i tumörceller underlättar vägledning en metastaserande melanom celler mot tumördränerande LNs16. Dessutom, extracellulära LN proteiner ger en självhäftande byggnadsställning för rekrytering och överlevnad cirkulerande tumörceller17. I själva verket, tumör-dränerande LNs ger bördig jord för sådd av DTCs, som kan upprätthållas i proliferativa eller vilande tillstånd av specifika LN mikromiljösignaler18. Det slutliga ödet för dessa LN-bosatta DTCs är kontroversiellt; vissa verk tyder på att dessa celler är passiva indikatorer på metastaserande progression19, medan andra föreslår att de är mer sannolika grundare av resistens (genom självsådd primära platser) och / eller fungera som cellulära reservoarer för metastaser (sprida “frön” för tertiär cancertillväxt)20,21. Nyligen, med hjälp av prekliniska modeller, har det visat sig att en bråkdel av dessa LN-bosatta DTCs aktivt invaderade blodkärl, trädde i blodcirkulationen och koloniserade lungorna21.
Med tanke på att förekomsten av cancerceller i LNs är en markör för cancer aggressivitet och invasivitet, i denna studie, optimerade vi en klassisk metod som utvecklats av Brodt22 för att kvantitativt mäta tumörcell vidhäftning till LNs in vitro. Användningen av en fluorescensbaserad analys gjorde det möjligt för oss att utveckla ett billigt, snabbt, känsligt och miljövänligt (icke-radioaktivt) protokoll för detektion av självhäftande förändringar mellan tumörceller och LN-kryosektioner. Med hjälp av MCF-7 bröstcancerceller uttrycker olika nivåer av NDRG4 genuttryck och råtta LN frysta sektioner för att exemplifiera metoden, visade vi att detta protokoll tillät en bra korrelation mellan tumörcell vidhäftning till LNs in vitro och LN metastasering observerats hos bröstcancerpatienter24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lymfsystemet spridning av cancerceller kräver en mängd komplexa cell-driven händelser. De initierar med cellavlossning från primär tumör och ombyggnad av den extracellulära matrisen (ECM) arkitektur, och stöds av ihållande chemotaxis och aktiv migration genom afferent lymfatika på väg till sentinel LNs. Om cancerceller följer och överlever i LNs, kan de lätt sprida sig till andra sekundära organ. Här beskriver vi en enkel metod för snabb och billig funktionell analys av specifika självhäftande interakt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Rosana De Lima Pagano och Ana Carolina Pinheiro Campos för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av bidrag från: FAPESP – São Paulo Research Foundation (2016/07463-4) och Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. 암 연구학. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. 암 연구학. 66 (10), 5151-5158 (2006).
