Identifikation af nye regulatorer af plantetranspiration ved storstilet termisk billeddannelse screening i Helianthus Annuus
Summary
Vi tilbyder en metode til at identificere modulatorer af bladtranspiration ved storstilet screening af et sammensat bibliotek.
Abstract
Plantetilpasning til biotiske og abiotiske belastninger styres af en række faktorer, blandt hvilke reguleringen af stomatal blænde som reaktion på vandunderskud eller patogener spiller en afgørende rolle. Identifikation af små molekyler, der regulerer stomatal bevægelse kan derfor bidrage til at forstå det fysiologiske grundlag, som planter tilpasse sig deres miljø. Storstilede screeningsmetoder, der er blevet anvendt til at identificere regulatorer af stomatal bevægelse har potentielle begrænsninger: nogle er stærkt afhængige af abscisic syre (ABA) hormon signalering vej, derfor udelukkeABA-uafhængige mekanismer, mens andre er afhængige af observation af indirekte, langsigtede fysiologiske virkninger såsom plantevækst og udvikling. Den screeningmetode, der præsenteres her, gør det muligt at behandle anlæg i stor skala med et bibliotek af kemikalier kombineret med en direkte kvantificering af deres transpiration ved termisk billeddannelse. Da fordampning af vand gennem transpiration resulterer i bladoverfladekøling, giver termisk billeddannelse en ikke-invasiv tilgang til at undersøge ændringer i stomatal ledningsevne over tid. I denne protokol dyrkes Helianthus annuus-planter hydroponically og behandles derefter ved rodfodring, hvor den primære rod skæres og dyppes i det kemikalie, der testes. Termisk billeddannelse efterfulgt af statistisk analyse af kotyledonære temperaturændringer over tid giver mulighed for identifikation af bioaktive molekyler modulerende stomatal blænde. Vores proof-of-concept eksperimenter viser, at et kemikalie kan transporteres fra skæret rod til cotyledon af solsikke kimplante inden for 10 minutter. Når planter behandles med ABA som en positiv kontrol, kan der desuden påvises en stigning i bladoverfladetemperaturen inden for få minutter. Vores metode giver således mulighed for effektiv og hurtig identifikation af nye molekyler, der regulerer stomatal blænde.
Introduction
Stresstolerance i planter er et polygent træk påvirket af en række molekylære, cellulære, udviklingsmæssige og fysiologiske egenskaber og mekanismer1. Planter i et svingende miljø skal løbende modulere deres stomatale bevægelser for at afbalancere den fotosyntetiske efterspørgsel efter kulstof og samtidig opretholde tilstrækkeligt vand og forhindre patoogen invasion2; De mekanismer, hvorved disse “afgørelser” træffes, forstås imidlertid dårligt3. Indførelse af bioaktive molekyler i planter kan modulere deres fysiologi og hjælpe med at sondere nye reguleringsmekanismer.
Den omfattende screening af små molekyler er en effektiv strategi, der anvendes i anti-cancer lægemiddel opdagelse og farmakologiske analyser til at teste de fysiologiske virkninger af hundreder til tusinder af molekyler i en kort periode4,5. I plantebiologi har høj gennemløbsscreening vist sin effektivitet,f.eks. Siden da, agonister og antagonister af ABA receptorer, og små molekyler i stand til at modulere udtrykket af ABA-inducible reporter gener er blevet identificeret9,10,11,12,13,14,15. High-throughput screening tilgange i øjeblikket til rådighed til at identificere små forbindelser, der kan modulere stomatal blænde har nogle ulemper: i) protokoller kredser omkring ABA signalering vej kan forhindre identifikation af nye ABA-uafhængige mekanismer, og (ii) in vivo strategier, der anvendes til identifikation af bioaktive små molekyler er primært afhængige af deres fysiologiske virkninger på frøspiring eller kimdannelse vækst, og ikke på regulering af plante transpiration i sig selv.
Derudover, mens der er mange måder at behandle planter med bioaktive molekyler, de fleste af dem er ikke velegnet til en storstilet undersøgelse af stomatal bevægelse. Kort, de tre mest almindelige teknikker er bladanvendelse ved sprøjtning eller dypning, behandling af rodsystemet, og rodkunstvanding. Bladapplikation er ikke kompatibel med de mest almindelige og hurtige metoder til måling af stomatblænde, da tilstedeværelsen af dråber på bladoverfladen forstyrrer storstilet dataindsamling. De vigtigste begrænsninger af rodvanding er de store prøve volumen krav, den potentielle fastholdelse af forbindelser af elementer i rhizosfæren, og afhængigheden af aktiv rodoptagelse.
Her præsenterer vi en storstilet metode til at identificere nye forbindelser, der regulerer plantetranspiration, og som ikke nødvendigvis involverer ABA- eller kendte tørkereaktionsmekanismer og giver mulighed for effektiv og pålidelig behandling af planter. I dette system behandles Helianthus annuusplanter ved hjælp af en rodfodringsmetode, der består i at skære den primære rod af planter dyrket hydroponically og dyppe afskæringsstedet i prøveopløsningen. Når de er behandlet, måles effekten af hvert stof på planternes transpiration ved hjælp af et infrarødt termisk billedkamera. Da en vigtig faktor for bladoverfladetemperatur er fordampningshastigheden fra bladet, kan termiske billeddata være direkte korreleret med stomatal ledningsevne. Den relative ændring i bladtemperaturen efter kemisk behandling giver således direkte mulighed for at kvantificere plantens transpiration.
H. annuus er en af de fem største oliefrø afgrøder i verden16 og opdagelser foretaget direkte på denne plante kan lette fremtidige overførsler af teknologi. Desuden har H. annuus planter store og flade cotyledons, samt en tyk primær rod, som var ideel til udviklingen af denne protokol. Men, denne metode kan let tilpasses til andre planter og en række forbindelser.
Denne protokol kan bruges til effektivt at identificere molekyler, der kan udløse stomatal lukning eller fremme stomatal åbning, hvilket har store konsekvenser for forståelsen af de signaler, der regulerer stomatal ledningsevne og plantetilpasning til miljømæssige Understreger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antallet af forbindelser, der kan testes på en given dag, afhænger for det meste af (i) den miljøkontrollerede plads, der er til rådighed til at dyrke planterne og udføre skærmen, samt (ii) antallet af personer, der kan være involveret i trin 6 i protokollen. Vi anbefaler brug af tre eksperimentelle replikater til at konsolidere fortolkningen af resultaterne efter statistisk behandling. I en typisk dag, en til to personer kan screene 60 forbindelser i treeksemplarer uden problemer ved at teste for eksempel [60 kem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af Pomona College Start-up fonde og Hirsch Research Indledning Grants Fund (til FJ) samt Pomona College Molekylær Biology Program gennem Stellar Summer Research Assistant Program (til KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
