Identifiering av nya regulatorer av växttranspiration genom storskalig termisk avbildningsscreening i Helianthus Annuus
Summary
Vi tillhandahåller en metod för att identifiera modulatorer av bladsompiration genom storskalig screening av ett sammansatt bibliotek.
Abstract
Växtanpassning till biotiska och abiotiska påfrestningar styrs av en rad olika faktorer, bland vilka regleringen av stomatal bländare som svar på vattenunderskott eller patogener spelar en avgörande roll. Identifiera små molekyler som reglerar stomatal rörelse kan därför bidra till att förstå den fysiologiska grund genom vilken växter anpassar sig till sin miljö. Storskaliga screeningmetoder som har använts för att identifiera regulatorer av stomatal rörelse har potentiella begränsningar: vissa är starkt beroende av abcscisic syra (ABA) hormon signalering väg, därför exklusive ABA-oberoende mekanismer, medan andra förlitar sig på observation av indirekta, långsiktiga fysiologiska effekter såsom växttillväxt och utveckling. Den screeningmetod som presenteras här möjliggör storskalig behandling av växter med ett bibliotek av kemikalier i kombination med en direkt kvantifiering av deras transpiration genom termisk avbildning. Eftersom avdunstning av vatten genom transpiration resulterar i bladytkylning, ger termisk avbildning en icke-invasiv metod för att undersöka förändringar i stomatal ledning över tiden. I detta protokoll odlas Helianthus annuus plantor hydroponiskt och behandlas sedan av rotmatning, där den primära roten skärs och doppas i kemikalien som testas. Termisk avbildning följt av statistisk analys av cotyledonary temperaturförändringar över tiden möjliggör identifiering av bioaktiva molekyler modulerande stomatal bländare. Våra proof-of-concept experiment visar att en kemikalie kan transporteras från den skurna roten till cotyledon av solros plantan inom 10 minuter. Dessutom, när växter behandlas med ABA som en positiv kontroll, kan en ökning av bladytans temperatur detekteras inom några minuter. Vår metod möjliggör därmed en effektiv och snabb identifiering av nya molekyler som reglerar stomatal bländare.
Introduction
Stresstolerans i växter är ett polygent drag som påverkas av en mängd olika molekylära, cellulära, utvecklings- och fysiologiska egenskaper och mekanismer1. Växter i en fluktuerande miljö måste kontinuerligt modulera sina stomatalrörelser för att balansera den fotosyntetiska efterfrågan på kol samtidigt som tillräckligt med vatten upprätthålls och förhindrapatogeninvasion2. De mekanismer genom vilka dessa avvägningsbeslut fattas är dock dåligtförstådda 3. Att införa bioaktiva molekyler i växter kan modulera deras fysiologi och hjälpa till att sondera nya regleringsmekanismer.
Den storskaliga screening av små molekyler är en effektiv strategi som används i anti-cancer drog upptäckt och farmakologiska analyser för att testa de fysiologiska effekterna av hundratals till tusentals molekyler på kort tid4,5. I växtbiologi, hög genomströmning screening har visat sin effektivitet till exempel i identifieringen av den syntetiska molekylen pyrabactin6, liksom upptäckten av den länge eftertraktade receptorn av abscisic syra (ABA)7,8. Sedan dess har agonister och antagonister av ABA-receptorer och små molekyler som kan modulera uttrycket av ABA-inducerar reporter gener har identifierats9,10,11,12,13,14,15. Med screeningmetoder med hög genomströmning för att identifiera små föreningar som kan modulera stomatal bländare har vissa nackdelar: (i) protokoll som kretsar kring ABA-signalvägen kan förhindra identifiering av nya ABA-oberoende mekanismer, och (ii) in vivo strategier som används för identifiering av bioaktiva små molekyler är främst beroende av deras fysiologiska effekter på utsäde grobarhet eller planta tillväxt, och inte på reglering en av anläggningen sedvänjning per se.
Dessutom, medan det finns många sätt att behandla växter med bioaktiva molekyler, de flesta av dem är inte väl lämpade för en storskalig studie av stomatal rörelse. Kortfattat, de tre vanligaste teknikerna är bladanvändning genom sprutning eller doppning, behandling av rotsystemet och rotbevattning. Bladapplicering är inte kompatibel med de vanligaste och snabba metoderna för att mäta stomatal bländare eftersom förekomsten av droppar på lövytan stör storskalig datainsamling. De största begränsningarna av rotbevattning är de stora kravprovvolymen, den potentiella lagringen av föreningarna av element i rhizosfären och beroendet av aktivt rotupptag.
Här presenterar vi en storskalig metod för att identifiera nya föreningar som reglerar växttranspiration som inte nödvändigtvis innebär ABA- eller kända torka-lyhörda mekanismer och möjliggör effektiv och tillförlitlig behandling av växter. I detta system behandlas Helianthus annuus växter med hjälp av en rotutfodring strategi som består i att skära den primära roten av plantor odlas hydroponically och doppa den skurna platsen i provlösningen. När den har behandlats mäts effekten av varje förening på växters inpiration med hjälp av en infraröd värmekamera. Eftersom en viktig bestämningsgrad för bladytans temperatur är avdunstningshastigheten från bladet, kan värmeavbildningsdata direkt korreleras till stomatal ledning. Den relativa förändringen i bladtemperaturen efter kemisk behandling ger således ett direkt sätt att kvantifiera växtens piration.
H. annuus är en av de fem största oljeväxter i världen16 och upptäckter som görs direkt på denna anläggning kan underlätta framtida överföringar av teknik. Dessutom har H. annuus plantor stora och platta cotyledons, samt en tjock primär rot, som var idealisk för utvecklingen av detta protokoll. Emellertid, Denna metod kan lätt anpassas till andra växter och en mängd olika föreningar.
Detta protokoll kan användas för att effektivt identifiera molekyler som kan utlösa stomatal stängning eller främja stomatal öppning, vilket har stora konsekvenser för att förstå de signaler som reglerar stomatal ledning och växtanpassning till miljö Betonar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antalet föreningar som kan testas på en viss dag beror oftast på (i) det miljökontrollerade utrymme som finns tillgängligt för att odla växterna och att utföra skärmen, liksom (ii) antalet individer som kan delta i steg 6 i protokollet. Vi rekommenderar användning av tre experimentella replikat för att konsolidera tolkningen av resultaten efter statistisk behandling. I en typisk dag, en till två individer kan skärm 60 föreningar i triplicates utan svårighet genom att testa till exempel [60 kemikalier + 6 n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av Pomona College Start-up Fonder och Hirsch Research Initiation Grants Fund (till FJ) samt Pomona College Molecular Biology Program genom Stellar Summer Research Assistant Program (till KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
