ForskydningAnalyse af myokardiemekanisk deformation (DIAMOND) afslører segmenteret heterogenitet af hjertefunktion i embryonale zebrafisk

Summary

Formålet med denne protokol er at detaljere en ny metode til vurdering af segmental hjertefunktion hos embryonale zebrafisk under både fysiologiske og patologiske tilstande.

Abstract

Zebrafisk er i stigende grad udnyttes som en model organisme for kardiomyotiatier og regenerering. Nuværende metoder evaluere hjertefunktion undlader at pålideligt opdage segmentale mekanik og er ikke let muligt i zebrafisk. Her præsenterer vi en halvautomatisk, open source-metode til kvantitativ vurdering af firedimensional (4D) segmental hjertefunktion: forskydningsanalyse af myokardiemekanisk deformation (DIAMOND). Transgene embryonale zebrafisk blev afbildet in vivo ved hjælp af et lysarkfluorescensmikroskopisystem med 4D-synkronisering med hjertemotion. Erhvervede 3D digitale hjerter blev rekonstrueret ved end-systole og end-diastole, og hjertekammer blev manuelt segmenteret i binære datasæt. Derefter blev hjertet omlagt og isotropisk resampled langs den sande korte akse, og hjertekammer var jævnt opdelt i otte portioner (I-VIII) langs den korte akse. På grund af de forskellige resampling-planer og matricer ved end-systole og end-diastole blev der anvendt en transformationsmatrix til billedregistrering for at genoprette den oprindelige rumlige forhold mellem de resamplede systoliske og diatoliciske billedmatricer. Efter billedregistrering blev forskydningsvektoren for hvert segment fra end-systole til end-diastol beregnet på grundlag af forskydningen af massecentroider i tre dimensioner (3D). DIAMOND viser, at basale myokardiesegmenter, der støder op til atrioventrikulær kanalen, gennemgår den højeste mekaniske deformation og er de mest modtagelige for doxorubicin-induceret hjerteskade. Samlet set giver DIAMOND ny indsigt i segmentale hjertemekanik i zebrafisk embryoner ud over traditionelle udslyngning fraktion (EF) under både fysiologiske og patologiske forhold.

Introduction

Kemoterapi-induceret hjertetoksicitet og efterfølgende hjertesvigt er en af hovedårsagerne til kemoterapi seponering^1. Derfor spiller hjertefunktionsvurdering en afgørende rolle i identifikationen af hjertetoksicitet og, hvad der er vigtigere, i forudsigelsen af tidlig hjerteskade efter kemoterapi^2. Men de nuværende tilgange til hjertefunktionel vurdering støder på begrænsninger. Metoder som venstre ventrikulær udslyngning fraktion (LVEF) giver kun globale og ofte forsinket hjertemekanik efter skade^3,4. Væv Doppler billeddannelse giver segmental myokardiedeformation oplysninger, men lider af betydelige intraobservatør og interobserverer variabilitet, dels på grund af ultralyd stråle vinkel afhængighed⁵. To-dimensionelle (2D) plet sporing udnytter B-tilstand ekkokardiografi, som teoretisk eliminerer vinkelafhængighed, men dens nøjagtighed er begrænset af out-of-plane bevægelse⁶. Derfor mangler der en streng tilgang til kvantificering af segmenteret hjertefunktion i både forskning og kliniske miljøer.

I denne sammenhæng udviklede vi en 4D-kvantificeringsmetode til analyse af segmental hjertefunktion, som vi kaldte forskydningsanalyse af myokardiemekanisk deformation (DIAMOND), for at bestemme forskydningsvektorerne for myokardiemassecentroider i 3D-rum. Vi anvendte DIAMOND til in vivo vurdering af hjertefunktion og doxorubicin-induceret hjertetoksicitet med zebrafisk(Danio rerio)som dyremodel, valgt på grund af deres regenererende myokardiet og højt bevarede udviklingsmæssige gener⁷. Vi sammenlignede yderligere segmentale DIAMOND forskydning med global udslyngning fraktion (EF) bestemmelse og 2D stamme efter doxorubicin behandling. Ved at integrere DIAMOND forskydning med 4D lysplade fluorescerende mikroskopi (LSFM) erhvervet rendering af embryonale zebrafisk hjerter, DIAMOND viser, at de basale myokardiesegmenter støder op til den atrioventrikulære kanalen gennemgå den højeste mekaniske deformation og er de mest modtagelige for akut doxorubicin hjerteskade⁸.

   

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af UCLA Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af UCLA Office of Animal Research. 1. Avl Tg(cmlc2:mCherry) zebrafisk og indsamling af embryoner Følg procedurerne for indsamling af boliger, avl og embryon som beskrevet i tidligere etablerede opdræts- og avlsmetoder. For yderligere oplysninger, se Messerschmidt et al.<sup clas…

Representative Results

Den proces, hvorved DIAMOND blev udviklet til vurdering af 3D-segmenthjertesygdom, præsenteres i figur 1. Efter LSFM-billederhvervelse og rekonstruktion i 3D af embryonale zebrafiskhjerte(figur 1A)blev det sande kortakseplan bestemt som plan vinkelret på de lodrette og vandrette lange akser, som begge bestemmes i en flerplanfremviser (figur 1B). Hjertet blev derefter resampled langs den korte akse…

Discussion

En streng strategi for kvantificering af segmental myokardiefunktion er afgørende for at vurdere hjertemekanik ud over traditionel EF, kendt for at være en ufølsom og forsinket indikator for myokardieskade^1,4,12. Derfor har der været en stigende interesse for markører for tidlige myokardieændringer, og en voksende mængde af litteratur understøtter myokardiedeformation parametre som en tidlig indikator for at forudsige ve…

Materials

Amira6	FEI		Image analyzing software
DAPT	Millipore Sigma	D5942-5MG
Doxorubicin hydrochloride	Millipore Sigma	D1515-10MG
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Millipore Sigma	E10521-10G	Tricaine
MATLAB	MathWorks		Programming environment
MATLAB Image Processing Toolbox	MathWorks		Image processing toolbox