Summary

Sequenciamento de RNA não codificador de tecidos reparados em formalina e exossomos derivados do soro de pacientes com câncer de próstata resistentes à castração

Published: November 19, 2019
doi:

Summary

A resistência terapêutica muitas vezes se desenvolve em pacientes com câncer de próstata avançado e, em alguns casos, o câncer progride para um subtipo letal chamado câncer de próstata neuroendócrino. Avaliar as pequenas alterações moleculares mediadas por RNA não codificadoras que facilitam essa transição permitiria uma melhor estratificação e identificação de mecanismos causais que levam ao desenvolvimento de câncer de próstata neuroendócrino.

Abstract

A blasmaioria do receptor andrógeno (AR) sinalização por privação de andrógeno é o objetivo da primeira linha de terapia para o câncer de próstata que inicialmente resulta em regressão do câncer. No entanto, em um número significativo de casos, a doença progride para o câncer de próstata avançado e resistente à castração (CRPC), que tem opções terapêuticas limitadas e muitas vezes é agressivo. A metástase distante é observada na maior parte nesta fase da doença agressiva. O CRPC é tratado por uma segunda geração de inibidores da via ar que melhoram a sobrevida inicialmente, seguida pelo surgimento da resistência terapêutica. O câncer de próstata neuroendócrino (NEPC) é uma variante rara do câncer de próstata (PCa) que muitas vezes se desenvolve como resultado da resistência à terapia através de um processo de transdiferenciação conhecido como diferenciação neuroendócrina (NED), em que as células pca passam por um interruptor de linhagem de adenocarcinomas e mostrar maior expressão de marcadores de linhagem neuroendócrina (NE). Além das alterações genômicas que impulsionam a progressão e a transdiferenciação para o NEPC, fatores epigenéticos e pistas microambientais são considerados atores essenciais na progressão da doença. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para identificar os drivers epigenéticos (ou seja, pequenos RNAs não codificadores) que estão associados a PCa avançados. Usando microRNAs purificadas de tecidos metastáticos embutidos em parafina (FFPE) fortificados formais e vesículas extracelulares (EVs) derivadas de soro correspondentes, o protocolo descreve como preparar bibliotecas com controle de qualidade adequado para sequenciamento microRNAs dessas fontes de amostra. Isolar o RNA de FFPE e EVs é muitas vezes desafiador porque a maior parte é degradada ou é limitada em quantidade. Este protocolo irá elaborar sobre diferentes métodos para otimizar as entradas de RNA e bibliotecas de CDNA para produzir leituras mais específicas e dados de alta qualidade após o sequenciamento.

Introduction

O câncer de próstata é impulsionado por andrógenos agindo via sinalização AR. Portanto, visando a via AR é o tratamento de esteio para a doença1. No entanto, a resistência muitas vezes se segue como resultado de terapias direcionadas e a doença progride para um CRPC metastático avançado2. Crpc é tratado pela segunda geração de terapia ar que inclui enzalutamida e abiraterona2,3 que melhora a sobrevivência inicialmente. No entanto, variantes letais como nepc muitas vezes surgem em 25-30% dos casos tratados CRPC que têm opções de tratamento limitada, levando ao aumento da mortalidade3. Nepc surge através de um processo de transdiferenciação reversível conhecido como NED, onde as células PCa passam por um interruptor de linhagem de adenocarcinomas e mostram diminuição da expressão de AR e maior expressão de marcadores de linhagem NE incluindo enolase 2 (ENO2), cromograna na a (CHGA) e sinaptophysin (SYP)4. Dado que essas variantes de resistência surgem como resultado de intervenções terapêuticas, é essencial decifrar caminhos que levam à geração desta forma mortal e difícil de tratar de PCa.

A genômica do NEPC foi recentemente decifrada em um estudo exaustivo feito por Beltran et al. em que foram analisadas 5 alterações de número de cópia, mutações, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e metilação de DNA de tecidos metastáticos derivados dopaciente. Apesar do avanço significativo na compreensão da genômica desta forma agressiva de PCa, pouco se sabe sobre os fatores epigenéticos, incluindo os pequenos RNAs não codificadores (microRNAs) que estão envolvidos na transição do CRPC-adenocarcinoma para o NEPC. MicroRNAs (miRNAs) são 22 bp longos, RNAs duplo-encalhados que agem primeiramente suprimindo a expressão do gene borne-transcriptionally por interações seqüência-específicas com as regiões 3′-untranslated (UTRs) de alvos cognate do mRNA6. Vários oncomiRs e supressores tumorais já foram identificados, e seu papel na regulação do início da doença e metástase tem sido bem estudado em diferentes cânceres6,7. Esses pequenos RNAs não codificadores muitas vezes servem como alvos muito importantes no controle da mortalidade por doenças6,8,9. Pesquisas mais recentes têm se concentrado na compreensão dos efeitos paracrinos dos miRNAs na metástase do câncer através de seu transporte em EVs, como exossomos, que fluem na corrente sanguínea e permitem que as células tumorais enviem esses mensageiros secundários para locais metastáticos em um ambiente livre de nuclease10,11,12. EVs transportar miRNAs das células tumorais para transferir os efeitos transformadores das células hospedeiras12. A identificação de EVs como mensageiros secundários de células tumorais pode, portanto, ser útil na detecção não invasiva da gravidade da doença.

O miR-1246 é altamente upregulated em EVs de PCa agressivo, e indica a gravidade da doença13. Estes miRNAs EV-associados servem não somente como biomarkers noninvasive da doença, mas jogam igualmente papéis funcional importantes em conduzir o tumorigenesis. Assim, é essencial compreender o significado do repertório miRNA que está associado a formas resistentes de PCa para permitir uma melhor identificação de biomarcadores não invasivos, bem como o seu significado funcional.

O advento do sequenciamento da próxima geração ofereceu a plataforma mais abrangente para estudar os detalhes da paisagem tumoral envolvendo alterações no genoma, como mutações, deslocalizações cromossômicas, cromotrípise e metilação, que contribuem significativamente para a forma e a natureza do câncer14,15,16. Da mesma forma, é também uma ferramenta essencial para entender as vastas mudanças epigenômicas que ocorrem em uma célula tumoral e que muitas vezes são jogadores importantes na gravidade da doença17. Com o objetivo de entender o repertório de miRNA associado à geração de NEPC, o sequenciamento de RNA pequeno foi realizado nos tecidos metastáticos de CRPC da FFPE e em seus EVs correspondentes derivados do soro. RNA derivado de qualquer uma dessas duas fontes de amostra é (1) baixo rendimento e (2) de má qualidade devido à degradação que muitas vezes acontece devido à fixação formalina e isolamento EV. Além disso, gerar bibliotecas de CDNA é um passo crítico, mas complicado, de uma corrida de sequenciamento. Assim, os métodos para isolar esses RNAs e usá-los para gerar bibliotecas para sequenciamento de RNA pequeno exigem otimização para gerar dados precisos e confiáveis.

Existem vários métodos para perfilar a expressão de miRNA em diferentes amostras, incluindo RT-PCR, microarrays e hibridização in situ (ISH). Um protocolo usando o RNA derivado do tecido ffpe para avaliar a expressão de miRNA por RT-PCR e ISH foi recentemente publicado18. Tecnologias mais recentes oferecem plataformas mais exaustivas e abrangentes para o perfil da expressão de miRNA em uma amostra. NanoString nCounter oferece uma plataforma de detecção de miRNA sensível19,mas a detecção é muitas vezes limitada pelo número de miRNAs que estão disponíveis na matriz (~ 2.000). Em tal cenário, uma plataforma mais sensível e exaustiva, como o sequenciamento da próxima geração, oferece uma profundidade muito maior de identificação de miRNA e perfis simultâneos em diferentes amostras20. O método tem sido usado para determinar as assinaturas miRNA na urina ou plasma de pacientes pcas21,22,23. No artigo atual, um protocolo é apresentado para usar uma plataforma de sequenciamento de próxima geração para estudar perfis de miRNA associados a CRPC agressivos usando tecidos FFPE e RNAs EV derivados do soro.

Protocol

Este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes éticas da Regra Comum dos EUA e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Pesquisa Humana. 1. Microdissese Nota: Os tecidos metastáticos de CRPC do FFPE com características do adenocarcinoma (CRPC-Adeno) ou a diferenciação do NE (CRPC-NE) foram obtidos da rede do biorepositório do cancro da próstata (PCBN). Seções pca de dez mícrons em lâminas de vidro foram preparadas para microdissec?…

Representative Results

A biblioteca foi preparada após o isolamento do RNA e uma verificação de qualidade foi realizada. Purificação de gel para a biblioteca cDNA amplificada preparada a partir de RNA isolada de tecidos microdissecizados e EVs derivados do soro é mostrada na Figura 1 e Figura 2. O tamanho do produto para miRNAs adaptador-ligados correspondeu a aproximadamente 136−160 bp para cada amostra. A Figura 1A-B é marcada …

Discussion

Neste artigo, descrevemos um protocolo para isolar o RNA dos tecidos da FFPE e EVs derivados do soro usando kits otimizados para aumentar o rendimento e a qualidade dos RNAs isolados. Além disso, os RNAs purificados foram usados para gerar bibliotecas de CDNA para sequenciamento de RNA pequeno. Ambas as etapas listadas são essenciais para determinar a qualidade e a profundidade das leituras de sequenciamento que são o resultado final da corrida24. Portanto, otimizar essas etapas cruciais é fun…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pela Us Army Medical Research Acquisition Activity (USAMRAA) através do Prêmio idea development underAward no. W81XWH-18-1-303 e W81XWH-18-2-0013 e, adicionalmente, pelo Prêmio nº. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018 e W81XWH-18-2-0019 Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). O apoio ao financiamento do laboratório de autores pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde (Grant Number RO1CA177984) também é reconhecido. Rajvir Dahiya é cientista sênior da carreira da pesquisa no departamento de casos dos veteranos, BX004473 e financiado por NIH-UO1CA199694 (RD). Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa ou pelo Exército dos EUA. Somos gratos a Judy Shigenaga, diretora de instalações centrais da San Francisco VAMC, por sua ajuda com o sequenciador NextSeq 500.

Materials

3M NaOAc pH 5.5 USB Corp. 75897 100 mL
5 µm filter tubes IST Engineering Inc. 5388-50
6% TBE polyacrylamide gels Novex EC6265BOX
BaseSpace Illumina Analysis software
Bio-analyzer Agilent
DNA loading dye Novex LC6678
Eppendorf Thermostat plus Eppendorf 1.5 mL
EtBr Pierce 17898
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco 111000200
Exosomal RNA isolation kit Norgen 58000
Gel breaking tubes IST Engineering Inc. 3388-100
Glycogen molecular biology grade Thermo Scientifc R0561
Hematoxylin Select Stat lab SL401
Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676 accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit Qiagen 217504
Nanodrop Thermo Scientifc Nano Drop 1000
Nanosight NTA Malvern LM14
NextSeq 500 Sequencer Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) Illumina FC-404-2001
Pellet paint Millipore 70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase Invitogen 18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant Lucigen LR2D11310K
TBE Running buffer (5X) Novex LC6675
Thermal cycler MJ Research PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum) Invitrogen 4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) Illumina RS-200-0012
Xylene Fisher Scientific X3P- 1GAL
RNA 3' Primer GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1 CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2 ACATCG
RNA PCR Index Primer 3 GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4 TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5 CACTGT
RNA PCR Index Primer 6 ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7 GATCTG
RNA PCR Index Primer 8 TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9 CTGATC
RNA PCR Index Primer 10 AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11 GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12 TACAAG

References

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Bhagirath, D., Dahiya, R., Majid, S., Tabatabai, Z. L., Saini, S. Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients. J. Vis. Exp. (153), e60549, doi:10.3791/60549 (2019).

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