Zell-Zell-Fusion des Genoms bearbeitete Zelllinien zur Störung der Zellstruktur und Funktion
Summary
Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, zwei verschiedene Zelltypen zu verschmelzen, um Hybridzellen zu erstellen. Die Fluoreszenzmikroskopie-Analyse von geschmolzenen Zellen wird verwendet, um die Ursprungszelle von Zellorganellen zu verfolgen. Dieser Test kann verwendet werden, um zu erforschen, wie Zellstruktur und Funktion auf Störungen durch Zellfusion reagieren.
Abstract
Das Leben ist räumlich in Lipidmembranen aufgeteilt, um die isolierte Bildung von unterschiedlichen molekularen Zuständen in Zellen und Organellen zu ermöglichen. Zellfusion ist die Verschmelzung von zwei oder mehr Zellen zu einer einzelnen Zelle. Hier stellen wir ein Protokoll zur Zellfusion von zwei verschiedenen Zelltypen bereit. Geschmolzene Hybridzellen werden durch strömungszytometriebasierte Sortierung angereichert, gefolgt von der Fluoreszenzmikroskopie der Hybridzellstruktur und -funktion. Fluoreszierend markierte Proteine, die durch genomische Bearbeitung erzeugt werden, werden in geschmolzenen Zellen abgebildet, so dass zelluläre Strukturen anhand der Fluoreszenzemission identifiziert und auf den Zelltyp des Ursprungs verwiesen werden können. Diese robuste und allgemeine Methode kann auf verschiedene Zelltypen oder Organellen von Interesse angewendet werden, um zelluläre Struktur und Funktion über eine Reihe von grundlegenden biologischen Fragen zu verstehen.
Introduction
Die panostatische Erhaltung der Zellstruktur ist lebenswichtig. Zellen haben charakteristische Morphologien, subzelluläre Organellenzahlen und eine interne biochemische Zusammensetzung. Um zu verstehen, wie diese grundlegenden Eigenschaften erzeugt werden und wie sie während der Krankheit schief gehen, müssen Laborwerkzeuge sie stören.
Zellfusion ist das Zusammenführen von zwei oder mehr getrennten Zellen. Zellfusion kann entscheidend für die Entstehung von eukaryotischen Leben gewesen sein1. Im menschlichen Körper ist die Zellfusion relativ selten, die bei eingeschränkten Entwicklungsbedingungen und Gewebetypen auftritt, z. B. während der Befruchtung oder der Bildung von Muskeln, Knochen und der Plazenta2. Dieses Protokoll beschreibt die Induktion der Zell-Zell-Fusion in Gewebekulturzelllinien mit differenziell fluoreszierend markierten Organellen als Einumreaktion auf die Mechanismen zur Steuerung von Zellstruktur und -funktion.
In vitro induzierte Zell-Zell-Fusion ist zentral für die Produktion von monoklonalen Antikörpern3, ein wichtiges Werkzeug für die biologische Forschung und Krankheitsbehandlung. Zellfusion wurde auch verwendet, um viele verschiedene grundlegende zellbiologische Fragen über Zellzyklus Dominanz4, Aneuploidie5,6, zelluläre Reprogrammierung7,8, die Reparatur von beschädigten Neuronen9, virale Proliferation10, Apoptose11, Tumorigenese12, Zytoskelettdynamik13, und Membranfusion14,15. Laborbasierte Methoden zur Induzieren von Zell-Zell-Fusion16,17,18,19 induzieren Lipidmembran Koaleszenz durch die physikalische Verschmelzung von zwei Doppelschichten in einem. Zellfusion kann durch Elektrizität induziert werden18, virale Methoden17, thermoplasmonische Erwärmung20, Transgenexpression19, und Chemikalien einschließlich Polyethylenglykol (PEG)16,21,22.
Centrosomen sind Mikrotubuli, die Zentren organisieren, die zelluläre Form, Beweglichkeit, Polarisation und Teilung23steuern. Centrosomale Wurzeln sind faserige Strukturen, die sich aus Zentrosomen erstrecken, die das Protein Rootletin24 enthalten (kodiert durch das Gen CROCC). Wir haben vor kurzem zell-Zell-Fusion verwendet, um zu verstehen, wie zentromische Position und Anzahl innerhalb von Heterokaryonen im Vergleich zu den Elternzellenvariiert 24. Der Grund für die Verwendung dieser Methode ist es, die Ursprungszelle von Wurzeln innerhalb eines Heterokaryons nach der Fusion von differenziell fluoreszierend markierten Elternzellen zu verfolgen und damit Organellefusion und -spaltung zu bilden. Die fluoreszierend getaggten Proteine rootletin-meGFP oder rootletin-mScarlet-I entstehen durch Genombearbeitung in separaten Zelllinien, die dann durch PEG-vermittelte Zellfusion verschmolzen werden. Wir beschreiben die Verwendung von Zellfarbstoffen (Materialtabelle) zur Identifizierung von geschmolzenen Zellen durch Durchflusszytometrie und anschließende Fluoreszenzmikroskopie-Identifikation von Zentromitenzelle und Morphologie (Abbildung 1). Dieser Ansatz ist eine robuste und einzigartige Methode, um zu untersuchen, wie große Veränderungen im Zellzustand einschließlich Organelle Zahl auf Zellhomöostase einwirken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir zeigen ein einfaches und kostengünstiges Protokoll zur Verschmelzung von Zellen und zur Visualisierung der nachfolgenden Architektur von Zellhybriden mit Mikroskopie, das von Anfang bis Ende etwa zwei Tage dauert. Kritische Teile dieses Protokolls sind die Anreicherung von geschmolzenen Zellen durch Zellsortierung (Protokollabschnitt 3) und die sorgfältige Validierung von geschmolzenen Zellen durch Mikroskopie (Protokollabschnitt 4). Diese Abschnitte stellen sicher, dass geschmolzene Zellen leicht erhalten werden u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einem Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship to R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant Nummer 100090/12/Z) finanziert. Der Geldgeber hatte keine Rolle bei der Erstellung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken Ashok Venkitaraman und Paul French für die kritische Beratung und Anleitung zu dem Projekt. Wir danken Chiara Cossetti und Gabriela Grondys-Kotarba im Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry für die hervorragende Unterstützung. Wir danken Liam Cassiday, Thomas Miller und Gianmarco Contino für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
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