मानव एमनियोटिक झिल्ली के विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों से एपिथेलियल कोशिकाओं की विट्रो संस्कृति में
Summary
यह प्रोटोकॉल नैदानिक और शारीरिक मॉडल में संभावित आवेदन के लिए उनकी विषमता और कार्यात्मक गुणों का निर्धारण करने के लिए मानव एमनियोटिक झिल्ली के विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों से एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है।
Abstract
मानव एमनियोटिक एपिथेलियल कोशिकाओं (एचईसी) के अलगाव और संस्कृति के लिए साहित्य में कई प्रोटोकॉल की सूचना दी गई है। हालांकि, ये मान लेते हैं कि एमनियोटिक एपिथेलियम एक सजातीय परत है। मानव एमनियन को तीन शारीरिक क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: परिलक्षित, अपरा, और गर्भनाल। प्रत्येक क्षेत्र में विभिन्न शारीरिक भूमिकाएं होती हैं, जैसे रोग की स्थिति में। यहां, हम तीन वर्गों में मानव एमनियन ऊतक को विच्छेदन करने और इसे विट्रो में बनाए रखने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। संस्कृति में, परावर्तित एमनियन से प्राप्त कोशिकाओं ने एक क्यूबॉइडल आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया, जबकि अपरा और नाल दोनों क्षेत्रों की कोशिकाएं स्क्वैमस थीं। फिर भी, प्राप्त सभी कोशिकाओं में एक एपिथेलियल फेनोटाइप होता है, जो ई-कैथेरिन के इम्यूनोडिटेक्शन द्वारा प्रदर्शित होता है। इस प्रकार, क्योंकि सीटू में अपरा और परिलक्षित क्षेत्र सेलुलर घटकों और आणविक कार्यों में भिन्न होते हैं, इन विट्रो अध्ययनों के लिए इन मतभेदों पर विचार करना आवश्यक हो सकता है, क्योंकि उनमें एचईसी के उपयोग के लिए शारीरिक निहितार्थ हो सकते हैं बायोमेडिकल अनुसंधान और पुनर्योजी चिकित्सा में इन कोशिकाओं का आशाजनक अनुप्रयोग।
Introduction
मानव एमनियोटिक एपिथेलियम कोशिकाएं (एचएईसी) भ्रूण विकास के शुरुआती दौर के दौरान लगभग आठ दिनों के पोस्टफर्टिलाइजेशन में उत्पन्न होती हैं। वे एपिब्लास्ट की स्क्वैमस एपिथेलियल कोशिकाओं की आबादी से उत्पन्न होते हैं जो एमनियोटिक झिल्लीकीअंतरतम परत से प्राप्त होते हैं । इस प्रकार, एचईसी को एपिब्लास्ट से प्लुरिपोटेम्पकोशिकाओं के अवशेष माना जाता है जिनमें भ्रूण2की तीन रोगाणु परतों में अंतर करने की क्षमता होती है। पिछले दशक में, विविध अनुसंधान समूहों ने इन कोशिकाओं को गर्भ की अवधि में एमनियोटिक झिल्ली से अलग करने के तरीके विकसित किए हैं ताकि विट्रो3,4में संस्कृति मॉडल में उनके प्रकल्पित बहुपक्षीयता से संबंधित गुणों की विशेषता हो सके।
तदनुसार, यह पाया गया है कि एचईसी में मानव pluripotent स्टेम सेल (HPSC) की विशेषता लक्षण हैं, जैसे सतह एंटीजन SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; प्लीरिपोटेंसी ट्रांसक्रिप्शन कारकों का मूल OCT4, SOX2, और NANOG; और प्रसार मार्कर KI67, सुझाव है कि वे स्वयं कर रहे है5नवीनीकरण,6,7. इसके अलावा, इन कोशिकाओं को तीन रोगाणु परतों (एक्टोडर्म, मेसोडर्म, और एंडोडर्म)4,5,8,साथ ही मानव रोगों के पशु मॉडल ों में वंश-विशिष्ट मार्कर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करने को चुनौती दी गई है। अंत में, HAEC एक्सप्रेस ई-cadherin, जो प्रदर्शित करता है कि वे HPSC5,9की तरह एक विशेषण प्रकृति बनाए रखने ।
उनके भ्रूणीय मूल के अलावा, एचईसी में अन्य आंतरिक गुण हैं जो उन्हें विभिन्न नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाते हैं, जैसे कि विरोधी भड़काऊ और जीवाणुरोधी अणुओं का स्राव10,11,विकास कारक और साइटोकिन रिलीज12,टेराटोमास का कोई गठन नहीं जब उन्हें एचपीएससी2के विपरीत इम्यूनोडेफिकेटिफिएंट चूहों में प्रत्यारोपित किया जाता है, और प्रतिरक्षा सहिष्णुता क्योंकि वे एचएलए-जी को व्यक्त करते हैं, जो एचएलए-जी को व्यक्त करते हैं, जो अस्वीकृति के जोखिम को कम कर देते हैं प्रत्यारोपण13.
हालांकि, पिछली रिपोर्टों ने माना है कि मानव एमनियन एक समरूप झिल्ली है, इस बात पर विचार किए बिना कि इसे शारीरिक रूप से और शारीरिक रूप से तीन क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: अपरा (एमनियन जो दशमलव बासलिसको कवर करता है), गर्भनाल (वह हिस्सा जो गर्भनाल को ढंकता है), और परिलक्षित होता है (बाकी झिल्ली अपरा से जुड़ी नहीं)14। यह दिखाया गया है कि एमनियन के अपरा और परिलक्षित क्षेत्र आकृति विज्ञान, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों15,मिरना अभिव्यक्ति16और सिग्नलिंग पाथवे17की सक्रियता में अंतर प्रदर्शित करते हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि मानव एमनियन विभिन्न कार्यक्षमता के साथ एक विषम आबादी द्वारा एकीकृत है जिसे सीटू या इन विट्रो मॉडल में किए गए आगे के अध्ययनों के लिए विचार किया जाना चाहिए। जबकि अन्य प्रयोगशालाओं ने पूरी झिल्ली से HAEC के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल डिजाइन किए हैं, हमारी प्रयोगशाला ने विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों से कोशिकाओं को अलग करने, संस्कृति और विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने एचईसी को शब्द झिल्ली से अलग करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल लागू किया। यह पिछली रिपोर्टों से अलग है कि प्रत्येक झिल्ली को हर एक से कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए अलगाव से पहले अपने तीन शारीरिक क्षेत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हमारे शोध को इंस्टीटो नैसिनल डी पेरिनाटोलोजिया डी मेक्सीको (21041 और 21081) और कोनेसाइट (A1-S-8450 और 252756) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम तकनीकी सहायता के लिए जेसिका गोंजालेज नॉरिस और लिडिया यूरिया पैरेडेस विवेस को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
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