Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana
Summary
Questo protocollo descrive l’isolamento delle cellule epiteliali da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana per determinarne l’eterogeneità e le proprietà funzionali per una possibile applicazione nei modelli clinici e fisiopatologici.
Abstract
Diversi protocolli sono stati riportati nella letteratura per l’isolamento e la coltura delle cellule epiteliali amniotiche umane (HAEC). Tuttavia, questi presuppongono che l’epitelio amniotico sia uno strato omogeneo. L’amnione umano può essere diviso in tre regioni anatomiche: riflesse, placentare e ombelicali. Ogni regione ha diversi ruoli fisiologici, come in condizioni patologiche. Qui, descriviamo un protocollo per sezionare il tessuto amnione umano in tre sezioni e mantenerlo in vitro. Nella coltura, le cellule derivate dall’amnione riflesso mostravano una morfologia cuboidale, mentre le cellule delle regioni placentarie e ombelicali erano squamose. Ciò nonostante, tutte le cellule ottenute hanno un fenotipo epiteliale, dimostrato dall’immunorilevamento dell’E-cadherin. Pertanto, poiché le regioni placentari e riflesse in situ differiscono nei componenti cellulari e nelle funzioni molecolari, potrebbe essere necessario che gli studi in vitro considerino queste differenze, poiché potrebbero avere implicazioni fisiologiche per l’uso dell’HAEC biomedica e la promettente applicazione di queste cellule nella medicina rigenerativa.
Introduction
Le cellule dell’epitelio amniotico umano (HAEC) hanno origine durante le prime fasi dello sviluppo embrionale, a circa otto giorni dopo la fecondazione. Nascono da una popolazione di cellule epiteliali squamose dell’epiblasto che derivano dallo strato più interno della membrana amniotica1. Così, HAEC sono considerati resti di cellule pluripotenti dall’epiblast che hanno il potenziale di differenziarsi nei tre strati germinali dell’embrione2. Nell’ultimo decennio, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per isolare queste cellule dalla membrana amniotica al termine di gestazione per caratterizzare le loro presunte proprietà legate alla pluripotenza in un modello culturale in vitro3,4.
Di conseguenza, è stato scoperto che HAEC presentano tratti caratteristici delle cellule staminali pluripotenti umane (HPSC), come gli antigeni superficiali SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; il nucleo dei fattori di trascrizione pluripotenza OCT4, SOX2 e NANOG; e il marcatore di proliferazione KI67, suggerendo che si stanno rinnovando5,6,7. Inoltre, queste cellule sono state sfidate utilizzando protocolli di differenziazione per ottenere cellule positive per marcatori specifici del lignaggio dei tre strati germinali (ectodermi, mesoderm ed endoderm)4,5,8, così come nei modelli animali di malattie umane. Infine, HAEC esprimono l’E-cadherin, che dimostrano che mantengono una natura epiteliale molto simile all’HPSC5,9.
Oltre alla loro origine embrionale, gli HAEC hanno altre proprietà intrinseche che le rendono adatte a diverse applicazioni cliniche, come la secrezione di molecole antinfiammatorie e antibatteriche10,11, fattori di crescita e citochina rilasciano12, nessuna formazione di teratomi quando vengono trapiantati in topi immunodeficienti in contrasto con HPSC2, e tolleranza logica perché esprimono HLA-G, che diminuisce il rischio di trapianto13.
Tuttavia, i rapporti precedenti hanno ipotizzato che l’amnione umano sia una membrana omogenea, senza considerare che possa essere suddivisa anatomicamente e fisiologicamente in tre regioni: placentale (l’amnione che copre la decidua basalis),ombelicale (la parte che avvolge il cordone ombelicale), e riflessa (il resto della membrana non attaccata alla placenta)14. È stato dimostrato che le regioni placentarie e riflesse dell’amnion mostrano differenze nella morfologia, nell’attività mitocondriale, nel rilevamento delle specie reattive dell’ossigeno15, sull’espressione miRNA16e nell’attivazione delle vie di segnalazione17. Questi risultati suggeriscono che l’amnione umano è integrato da una popolazione eterogenea con funzionalità diverse che dovrebbero essere prese in considerazione per ulteriori studi condotti in modelli in situ o in vitro. Mentre altri laboratori hanno progettato protocolli per l’isolamento di HAEC da tutta la membrana, il nostro laboratorio ha stabilito un protocollo per isolare, coltura e caratterizzare le cellule provenienti da diverse regioni anatomiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo implementato un nuovo protocollo per isolare l’HAEC dalle membrane di termine. Si differenzia dai rapporti precedenti in quanto ogni membrana è stata divisa nelle sue tre regioni anatomiche prima dell’isolamento per analizzare le cellule da ciascuna di esse.
Uno dei passaggi più critici nel protocollo è il lavaggio della membrana per rimuovere tutti i coaguli di sangue, perché possono interferire con l’attività della trypsin quando si separano le cellule epiteliali. La mancata ese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La nostra ricerca è stata sostenuta dalle sovvenzioni dell’Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 e 21081) e del CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Ringraziamo Jessica Gonzàlez Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas per il supporto tecnico.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
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