In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Fruchtwassermembran, um deren Heterogenität und funktionelle Eigenschaften für eine mögliche Anwendung in klinischen und physiopathologischen Modellen zu bestimmen.
Abstract
In der Literatur wurden mehrere Protokolle zur Isolierung und Kultur menschlicher Fruchtwasserepithelzellen (HAEC) berichtet. Diese gehen jedoch davon aus, dass es sich bei dem Fruchtioziumepithel um eine homogene Schicht handelt. Das menschliche Amnion kann in drei anatomische Regionen unterteilt werden: reflektiert, Plazenta und Nabel. Jede Region hat unterschiedliche physiologische Rollen, z. B. in pathologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um menschliches Amniongewebe in drei Abschnitten zu sezieren und in vitro zu pflegen. In der Kultur zeigten Zellen, die aus dem reflektierten Amnion abgeleitet wurden, eine quakodeale Morphologie, während Zellen aus Plazenta- und Nabelregionen plattenförmig waren. Nichtsdestotrotz haben alle erhaltenen Zellen einen epitheliale Phänotyp, der durch die Immundetektion von E-Cadherin nachgewiesen wird. Da sich die Plazenta- und reflektierten Regionen vor Ort in zellulären Komponenten und molekularen Funktionen unterscheiden, kann es daher für In-vitro-Studien notwendig sein, diese Unterschiede zu berücksichtigen, da sie physiologische Auswirkungen auf die Verwendung von HAEC in biomedizinische Forschung und die vielversprechende Anwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin.
Introduction
Menschliche Fruchtiotische Epithelzellen (HAEC) entstehen in den frühen Stadien der embryonalen Entwicklung, etwa acht Tage nach der Befruchtung. Sie entstehen aus einer Population von Plattenepithelzellen des Epiblasts, die sich aus der innersten Schicht der Fruchtwassermembran1ableiten. So gelten HAEC als Reste pluripotenter Zellen aus dem Epiblast, die das Potenzial haben, sich in die drei Keimschichten desEmbryos 2zu differenzieren. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Forschungsgruppen Methoden entwickelt, um diese Zellen aus der Fruchtwassermembran zum Term der Trächtigkeit zu isolieren, um ihre mutmaßlichen pluripotenzbedingten Eigenschaften in einem Kulturmodell in vitro3,4zu charakterisieren.
Dementsprechend wurde festgestellt, dass HAEC-Merkmale, die für humane pluripotente Stammzellen (HPSC) charakteristisch sind, wie die Oberflächenantigene SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; der Kern der Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2 und NANOG; und der Proliferationsmarker KI67, was darauf hindeutet, dass sie sich selbsterneuern5,6,7. Darüber hinaus wurden diese Zellen mit Differenzierungsprotokollen herausgefordert, um Zellen positiv für linienspezifische Marker der drei Keimschichten (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm)4,5,8, sowie in Tiermodellen menschlicher Krankheiten zu erhalten. Schließlich, HAEC Express E-Cadherin, die zeigen, dass sie eine epitheliale Natur ähnlich wie die HPSC5,9behalten.
Abgesehen von ihrem embryonalen Ursprung haben HAEC andere intrinsische Eigenschaften, die sie für verschiedene klinische Anwendungen geeignet machen, wie die Sekretion von entzündungshemmenden und antibakteriellen Molekülen10,11, Wachstumsfaktoren und Zytokinfreisetzung12, keine Bildung von Teratomen, wenn sie in immundefizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizide Mäuse im Gegensatz zu HPSC2transplantiert werden, und immunologische Toleranz, weil sie HLA-G ausdrücken, was das Risiko der Abstoßung nach Transplantation13.
Frühere Berichte gingen jedoch davon aus, dass das menschliche Amnion eine homogene Membran ist, ohne zu berücksichtigen, dass es anatomisch und physiologisch in drei Regionen unterteilt werden kann: Plazenta (das Amnion, das die Decidua basalisbedeckt), Nabel (der Teil, der die Nabelschnur umschließt) und reflektiert (der Rest der Membran nicht an der Plazenta befestigt)14. Es wurde gezeigt, dass die Plazenta- und reflektierten Regionen des Amnion Unterschiede in der Morphologie, mitochondrialen Aktivität, Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies15, miRNA-Expression16und Aktivierung von Signalwegen17zeigen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das menschliche Amnion von einer heterogenen Population mit unterschiedlicher Funktionalität integriert wird, die für weitere Studien in In-situ- oder In-vitro-Modellen in Betracht gezogen werden sollte. Während andere Laboratorien Protokolle für die Isolierung von HAEC von der gesamten Membran entwickelt haben, hat unser Labor ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Zellen aus verschiedenen anatomischen Regionen erstellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben ein neues Protokoll implementiert, um HAEC von Termmembranen zu isolieren. Es unterscheidet sich von früheren Berichten dadurch, dass jede Membran vor der Isolierung in ihre drei anatomischen Bereiche unterteilt wurde, um Zellen von jedem zu analysieren.
Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist das Waschen der Membran, um alle Blutgerinnsel zu entfernen, da sie die Aktivität von Trypsin bei der Trennung der Epithelzellen stören können. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unsere Forschung wurde durch Stipendien des Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 und 21081) und CONACYT (A1-S-8450 und 252756) unterstützt. Wir danken Jessica Gonzalez Norris und Lidia Yuriria Paredes Vivas für die technische Unterstützung.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
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