Summary

Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana

Published: November 28, 2019
doi:

Summary

Questo protocollo descrive l’isolamento delle cellule epiteliali da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana per determinarne l’eterogeneità e le proprietà funzionali per una possibile applicazione nei modelli clinici e fisiopatologici.

Abstract

Diversi protocolli sono stati riportati nella letteratura per l’isolamento e la coltura delle cellule epiteliali amniotiche umane (HAEC). Tuttavia, questi presuppongono che l’epitelio amniotico sia uno strato omogeneo. L’amnione umano può essere diviso in tre regioni anatomiche: riflesse, placentare e ombelicali. Ogni regione ha diversi ruoli fisiologici, come in condizioni patologiche. Qui, descriviamo un protocollo per sezionare il tessuto amnione umano in tre sezioni e mantenerlo in vitro. Nella coltura, le cellule derivate dall’amnione riflesso mostravano una morfologia cuboidale, mentre le cellule delle regioni placentarie e ombelicali erano squamose. Ciò nonostante, tutte le cellule ottenute hanno un fenotipo epiteliale, dimostrato dall’immunorilevamento dell’E-cadherin. Pertanto, poiché le regioni placentari e riflesse in situ differiscono nei componenti cellulari e nelle funzioni molecolari, potrebbe essere necessario che gli studi in vitro considerino queste differenze, poiché potrebbero avere implicazioni fisiologiche per l’uso dell’HAEC biomedica e la promettente applicazione di queste cellule nella medicina rigenerativa.

Introduction

Le cellule dell’epitelio amniotico umano (HAEC) hanno origine durante le prime fasi dello sviluppo embrionale, a circa otto giorni dopo la fecondazione. Nascono da una popolazione di cellule epiteliali squamose dell’epiblasto che derivano dallo strato più interno della membrana amniotica1. Così, HAEC sono considerati resti di cellule pluripotenti dall’epiblast che hanno il potenziale di differenziarsi nei tre strati germinali dell’embrione2. Nell’ultimo decennio, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per isolare queste cellule dalla membrana amniotica al termine di gestazione per caratterizzare le loro presunte proprietà legate alla pluripotenza in un modello culturale in vitro3,4.

Di conseguenza, è stato scoperto che HAEC presentano tratti caratteristici delle cellule staminali pluripotenti umane (HPSC), come gli antigeni superficiali SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; il nucleo dei fattori di trascrizione pluripotenza OCT4, SOX2 e NANOG; e il marcatore di proliferazione KI67, suggerendo che si stanno rinnovando5,6,7. Inoltre, queste cellule sono state sfidate utilizzando protocolli di differenziazione per ottenere cellule positive per marcatori specifici del lignaggio dei tre strati germinali (ectodermi, mesoderm ed endoderm)4,5,8, così come nei modelli animali di malattie umane. Infine, HAEC esprimono l’E-cadherin, che dimostrano che mantengono una natura epiteliale molto simile all’HPSC5,9.

Oltre alla loro origine embrionale, gli HAEC hanno altre proprietà intrinseche che le rendono adatte a diverse applicazioni cliniche, come la secrezione di molecole antinfiammatorie e antibatteriche10,11, fattori di crescita e citochina rilasciano12, nessuna formazione di teratomi quando vengono trapiantati in topi immunodeficienti in contrasto con HPSC2, e tolleranza logica perché esprimono HLA-G, che diminuisce il rischio di trapianto13.

Tuttavia, i rapporti precedenti hanno ipotizzato che l’amnione umano sia una membrana omogenea, senza considerare che possa essere suddivisa anatomicamente e fisiologicamente in tre regioni: placentale (l’amnione che copre la decidua basalis),ombelicale (la parte che avvolge il cordone ombelicale), e riflessa (il resto della membrana non attaccata alla placenta)14. È stato dimostrato che le regioni placentarie e riflesse dell’amnion mostrano differenze nella morfologia, nell’attività mitocondriale, nel rilevamento delle specie reattive dell’ossigeno15, sull’espressione miRNA16e nell’attivazione delle vie di segnalazione17. Questi risultati suggeriscono che l’amnione umano è integrato da una popolazione eterogenea con funzionalità diverse che dovrebbero essere prese in considerazione per ulteriori studi condotti in modelli in situ o in vitro. Mentre altri laboratori hanno progettato protocolli per l’isolamento di HAEC da tutta la membrana, il nostro laboratorio ha stabilito un protocollo per isolare, coltura e caratterizzare le cellule provenienti da diverse regioni anatomiche.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico dell’Instituto Nacional de Perinatologa a Città del Messico (numero di registro 212250-21041). Tutte le procedure eseguite in questi studi erano conformi agli standard etici dell’Instituto Nacional de Perinatolog, della Dichiarazione di Helsinki e delle linee guida stabilite nello standard messicano ufficiale del Ministero della Salute. 1. Preparazione Preparare una soluzione di 1x PBS con EDTA. A tale scopo, aggiungere 500 : L…

Representative Results

Gli HAEC sono stati isolati da ciascuna delle tre regioni anatomiche della membrana amniotica e coltivati individualmente in vitro. Dopo 48 h di coltura, le cellule con un fenotipo epiteliale aderito alla superficie della piastra, anche se i media contenevano anche detriti cellulari e cellule galleggianti, che sono stati rimossi una volta che il mezzo è stato cambiato (Figura 3). Durante l’elaborazione della cultura primaria (passaggio zero, P0), potrebbero sorge…

Discussion

Abbiamo implementato un nuovo protocollo per isolare l’HAEC dalle membrane di termine. Si differenzia dai rapporti precedenti in quanto ogni membrana è stata divisa nelle sue tre regioni anatomiche prima dell’isolamento per analizzare le cellule da ciascuna di esse.

Uno dei passaggi più critici nel protocollo è il lavaggio della membrana per rimuovere tutti i coaguli di sangue, perché possono interferire con l’attività della trypsin quando si separano le cellule epiteliali. La mancata ese…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La nostra ricerca è stata sostenuta dalle sovvenzioni dell’Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 e 21081) e del CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Ringraziamo Jessica Gonzàlez Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas per il supporto tecnico.

Materials

Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

References

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Cite This Article
Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

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