В vitro Культура эпителиальных клеток из различных анатомических регионов амниотической Мембраны человека
Summary
Этот протокол описывает изоляцию эпителиальных клеток из различных анатомических областей амниотической мембраны человека для определения их неоднородности и функциональных свойств для возможного применения в клинических и физиопатологических моделях.
Abstract
Несколько протоколов были зарегистрированы в литературе для изоляции и культуры человека амниотических эпителиальных клеток (HAEC). Однако они предполагают, что амниотический эпителий является однородным слоем. Амнион человека можно разделить на три анатомические области: отраженную, плацентарную и пупочную. Каждый регион имеет различные физиологические роли, например, в патологических условиях. Здесь мы описываем протокол для вскрытия ткани амниона человека в трех разделах и поддерживать его в пробирке. В культуре клетки, полученные из отраженного амниона, отображали кубоидальную морфологию, в то время как клетки как из плацентарных, так и из пупочных областей были плоскоклеточными. Тем не менее, все полученные клетки имеют эпителиальный фенотип, продемонстрированный иммунообнаружением E-кадерин. Таким образом, поскольку плацентарные и отраженные области на месте отличаются в клеточных компонентах и молекулярных функциях, может потребоваться для исследования in vitro рассмотреть эти различия, поскольку они могут иметь физиологические последствия для использования HAEC в биомедицинских исследований и перспективного применения этих клеток в регенеративной медицине.
Introduction
Клетки амниотического эпителия человека (HAEC) возникают на ранних стадиях эмбрионального развития, примерно в восемь дней послеоплодизации. Они возникают из популяции плоскоклеточных эпителиальных клеток эпибласта, которые вытекают из внутреннего слоя амниотической мембраны1. Таким образом, HAEC считаются остатками плюрипотентных клеток из эпибласта, которые имеют потенциал, чтобы дифференцироваться в три слоя зародыша эмбриона2. В последнее десятилетие, различные исследовательские группы разработали методы, чтобы изолировать эти клетки от амниотической мембраны в срок беременности, чтобы охарактеризовать их предполагаемых плюрипотентных свойств, связанных с культурой в пробирке3,4.
Соответственно, было установлено, что HAEC особенность черты, характерные для человека плюрипотентных стволовых клеток (HPSC), таких как поверхностные антигены SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; ядро факторов транскрипции pluripotency OCT4, SOX2 и NANOG; и маркер распространения KI67, предполагая, что они самообновляются5,6,7. Кроме того, эти клетки были оспорены с помощью протоколов дифференциации для получения клеток, положительных для линейных конкретных маркеров трех слоев микробов (эктодерм, мезодерм, и эндодерм)4,5,8, а также в животных моделей человеческих заболеваний. Наконец, HAEC выразить E-кадерин, которые демонстрируют, что они сохраняют эпителиальный характер так же, как HPSC5,9.
Помимо их эмбрионального происхождения, HAEC имеют другие свойства, которые делают их пригодными для различных клинических применений, таких как секреция противовоспалительных и антибактериальных молекул10,11, факторы роста и цитокинов релиз12, не образование тератомы, когда они пересажены в иммунодефицитных мышей в отличие от HPSC2, и иммуно-толерной толерантности, потому что они выражают HLA-G отказ, который трансплантация13.
Однако, предыдущие доклады предполагали, что амнион человека является однородной мембраной, не учитывая, что она может быть анатомически и физиологически разделена на три области: плацентарный (амнион, который охватывает decidua базалис),пупочная (часть, которая обволакивает пуповину), и отражается (остальная часть мембраны не прилагается к плаценте)14. Было показано, что плацентарные и отраженные области амниона отображают различия в морфологии, митохондриальной активности, обнаружении реактивных видов кислорода15, выражении миРНК16, и активации сигнальных путей17. Эти результаты свидетельствуют о том, что амнион человека интегрируется в разнородную популяцию с различной функциональностью, которая должна быть рассмотрена для дальнейших исследований, проведенных в situ или in vitro моделей. В то время как другие лаборатории разработали протоколы для изоляции HAEC от всей мембраны, наша лаборатория разработала протокол для изоляции, культуры и характеристики клеток из различных анатомических регионов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы внедрили новый протокол для изоляции HAEC от терминовых мембран. Он отличается от предыдущих докладов в том, что каждая мембрана была разделена на три анатомических регионов до изоляции для анализа клеток от каждого из них.
Одним из наиболее важных шагов в протоколе явл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Наше исследование было поддержано грантами Национального института Перинатологии Мексики (21041 и 21081) и CONACYT (A1-S-8450 и 252756). Мы благодарим Джессику Гонсалес Норрис и Лидию Юририю Паредес Вивас за техническую поддержку.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
