الحث المبرمج والكشف في الثقافة الاساسيه للخلايا المعوية الخيار البحر
Summary
هذا البروتوكول يوفر طريقه سهله للتعامل مع الثقافة الخلايا المعوية من خيار البحر ابوستيتشوكوس japonغاريس ومتوافق مع مجموعه متنوعة من العينات الانسجه المتاحة علي نطاق واسع من الكائنات البحرية بما في ذلك اشوداء الجلد ، الرخويات ، قشريات.
Abstract
وتستخدم الخلايا المستزرعة الاوليه في مجموعه متنوعة من التخصصات العلمية كاداات هامه للغاية للتقييم الوظيفي للمواد البيولوجية أو توصيف الانشطه البيولوجية المحددة. ومع ذلك ، ونظرا لعدم وجود وسائل الاعلام الثقافة الخلية المطبقة عالميا والبروتوكولات ، وصفا جيدا أساليب ثقافة الخلية للكائنات البحرية لا تزال محدوده. وفي الوقت نفسه ، فان التلوث الجرثومي والخواص المتعددة المدارات للخلايا لافقاريات البحرية التي تحدث بشكل شائع تعيق إنشاء استراتيجية فعاله لاستزراع الخلايا في لافقاريات البحرية. هنا ، ونحن وصف طريقه سهله التعامل لزراعه الخلايا المعوية من الخيار البحر ابوستيشووس جابونوكوس. بالاضافه إلى ذلك ، ونحن نقدم مثالا علي الحث في المختبر المبرمج والكشف في الخلايا المعوية المستزرعة الاوليه. وعلاوة علي ذلك ، توفر هذه التجربة تفاصيل حول أسلوب الثقافة المناسبة ومجموعه الخلايا. البروتوكول الموصوف متوافق مع مجموعه متنوعة من عينات الانسجه المتاحة علي نطاق واسع من الكائنات البحرية بما في ذلك الجلد الشحمي ، الرخويات ، قشريات ، ويمكن ان توفر خلايا كافيه للعديد من التطبيقات التجريبية في المختبر. ومن شان هذه التقنية ان تمكن الباحثين من التلاعب بكفاءة بثقافات الخلايا الاوليه من لافقاريات البحرية وتيسير التقييم الوظيفي للمواد البيولوجية المستهدفة علي الخلايا.
Introduction
وتوفر الخلايا المزروعة تحت ظروف خاضعه للسيطرة المصطنعة ، وليس في بيئتها الطبيعية ، مواد تجريبية موحده للدراسات البيولوجية ، وخاصه بالنسبة للأنواع التي لا يمكن زراعتها بسهوله في بيئة مختبريه. تمثل لافقاريات البحرية أكثر من 30% من جميع أنواع الماشية1، وتوفر العديد من المواد البيولوجية لاجراء البحوث حول أليات التنظيمية لعمليات بيولوجية محدده ، مثل التجديد2،3، الاستجابة للإجهاد4، والتكيف البيئي5،6.
خيار البحر ، Apostichopus japonغاريكوس، هو واحد من الأنواع اشوديرم الأكثر دراسة التي تسكن المياه المعتدلة علي طول ساحل شمال المحيط الهادي. ومن المعروف جيدا باسم الأنواع الهامه تجاريا والمراسي علي نطاق واسع في شرق اسيا ، وخاصه في الصين7. العديد من الاسئله العلمية المتعلقة ب. japonغاريكوس، بما في ذلك أليات التنظيمية الكامنة وراء التجدد المعوي بعد أحشاء8 وانحطاط في استيميل9، والسيطرة الايضيه10،11، واستجابه المناعي12،13 تحت الضغوط الحرارية أو المسببة للامراض ، ومع ذلك ، بالمقارنة مع الحيوانية نموذج مدروسه جيدا ، والبحوث الاساسيه ، وخاصه علي المستوي الخلوي ، محدوده بالاختناقات التقنية ، مثل عدم وجود أساليب متقدمة ثقافة الخلية.
وقد كرس الباحثون الكثير من الجهد لإنشاء خطوط خلوية ، ولكنهم واجهوا أيضا العديد من التحديات ولم يتم إنشاء اي خط خلوي من اي لافقاريات بحري حتى الآن14. ومع ذلك ، فقد تقدمت ثقافات الخلايا الاوليه من لافقاريات البحرية في العقود الاخيره15،16، وانها أتاحت فرصه لتجريب علي المستوي الخلوي. فعلي سبيل المثال ، استخدمت الخلايا المتجددة من ا. japonغاريكوس كمصدر للخلايا لثقافات الخلايا طويلة الأجل التي وفرت طريقه عمليه لثقافة الخلايا الاوليه لافقاريات البحرية17. ويجمع هذا البروتوكول والأمثل بين ثقافة الخلية لافقارياته ويطور أسلوبا للثقافة الاوليه مناسبا علي نطاق واسع لخيار البحر أو لافقاريات البحرية الأخرى.
المبرمج هو برنامج انتحار الخلية المتاصله التي تسببها مختلف المحفزات الخارجية والمحلية. تنسيق المبرمج هو أمر حاسم بالنسبة للعديد من النظم البيولوجية18,19, وقد تورطت في الانحدار المعوي من خيار البحر اثناء الاستيميل9. للتحقيق في عمليه ابوتوتيك في الكائنات الحية من الفائدة ، وقد تم إنشاء سلسله من الطرق ، بما في ذلك تلطيخ Hoechst واختبارات المجهر ، وتطبيقها بنجاح20. هنا ، أجرينا الحث المبرمج والكشف في الخلايا المعوية المستزرعة الاوليه من خيار البحر لتقييم قابليه استخدام الخلايا الاوليه في الدراسات البيولوجية لافقاريات البحرية. وقد استخدم ديكساميثازون ، واحده من كورتيزون الاصطناعية الشائعة الاستخدام21، للحث علي المبرمج في الخلايا المعوية مثقف من خيار البحر ، وتم الكشف عن اشاره Hoechst 33258 كبيره بنجاح في الخلايا الملونة عن طريق المجهر الفلورسنت.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد كرست جهود بحثيه مكثفه لإنشاء خطوط خلوية في العقود الاخيره ، ومع ذلك ، لا يزال من الصعب احراز تقدم بشان الثقافة الطويلة الأجل للخلايا من لافقاريات البحرية14،22. وقد أفيد بان الخلايا المستزرعة من تجديد انسجه هولوثوريان كانت قابله للحياة لفتره طويلة من الزم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا البروفيسور ناصوب تشو من جامعه تشجيانغ علي مشورته التقنية وعلي جعل معدات مختبره متاحه للاستعمال. وقد دعم هذا العمل ماليا المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 41876154 ، 41606150 ، 41406137) وصناديق البحوث الاساسيه للجامعات ومعاهد البحوث في مقاطعه تشجيانغ [منح عدد 2019JZ00007 ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
