Apoptosis inductie en detectie in een primaire cultuur van zee komkommer darmcellen
Summary
Dit protocol biedt een eenvoudig te hanteren methode voor het kweken van de darmcellen van Sea komkommer Apostichopus japonicus en is compatibel met een verscheidenheid aan breed beschikbare weefselmonsters van mariene organismen, waaronder Echinodermata, slakken, en Crustacea.
Abstract
Primaire gekweekte cellen worden gebruikt in een verscheidenheid van wetenschappelijke disciplines als uitzonderlijk belangrijke instrumenten voor de functionele evaluatie van biologische stoffen of de karakterisering van specifieke biologische activiteiten. Echter, vanwege het gebrek aan universeel toepasbare celcultuur media en protocollen, zijn goed beschreven celkweek methoden voor mariene organismen nog steeds beperkt. Ondertussen belemmeren de vaak voorkomende microbiële besmetting en polytrope eigenschappen van mariene ongewervelde cellen de totstandbrenging van een effectieve celcultuur strategie voor ongewervelde mariene organismen. Hier beschrijven we een gemakkelijk te hanteren methode voor het kweken van darmcellen van zeekomkommer Apostichopus japonicus; Daarnaast bieden we een voorbeeld van in vitro apoptosis inductie en detectie in primaire gekweekte intestinale cellen. Bovendien biedt dit experiment informatie over de juiste methode voor kweekmedium en celverzameling. Het beschreven protocol is compatibel met een verscheidenheid aan breed beschikbare weefselmonsters van mariene organismen, waaronder Echinodermata, slakken, en Crustacea, en het kan voldoende cellen bieden voor meervoudige in vitro experimentele toepassingen. Deze techniek zou onderzoekers in staat stellen om de primaire celculturen efficiënt te manipuleren van ongewervelde mariene organismen en om de functionele evaluatie van gerichte biologische materialen op cellen te vergemakkelijken.
Introduction
Het kweken van cellen onder kunstmatig gecontroleerde omstandigheden, en niet in hun natuurlijke omgeving, biedt uniforme experimentele materialen voor biologische studies, vooral voor soorten die niet gemakkelijk kunnen worden gekweekt in een laboratoriumomgeving. Mariene ongewervelde dieren zijn meer dan 30% van alle diersoorten1en bieden talrijke biologische materialen voor onderzoek naar de regelgevings mechanismen van specifieke biologische processen, zoals regeneratie2,3, stress response4en aanpassing aan de milieu-adaptatie5,6.
De zeekomkommer, apostichopus japonicus, is een van de meest bestudeerde stekelhuidigen soorten die in gematigde wateren langs de Noord-Pacifische kust wonen. Het is bekend als een commercieel belangrijke soort en mariculit op grote schaal in Oost-Azië, met name in China7. Tal van wetenschappelijke vragen met betrekking tot A. japonicus, met inbegrip van de regelgevende mechanismen onderliggende intestinale regeneratie na ontbranding8 en degeneratie in aestivation9, metabole controle10,11, en immuunrespons12,13 onder thermische of pathogene spanningen, hebben de aandacht van onderzoekers aangetrokken. Echter, in vergelijking met goed bestudeerde model dieren, fundamenteel onderzoek, vooral op cellulair niveau, wordt beperkt door technische knelpunten, zoals het ontbreken van geavanceerde celcultuurmethoden.
Onderzoekers hebben veel moeite gedaan om cellijnen vast te stellen, maar ze hebben ook veel uitdagingen ondervonden en er is geen cellijn van een mariene ongewervelde opgericht, maar14. Echter, primaire celculturen van mariene ongewervelde dieren hebben gevorderd in de laatste decennia15,16, en ze hebben een kans voor experimenten op cellulair niveau geboden. Bijvoorbeeld, de regenererende intesine van A. japonicus is gebruikt als een bron van cellen voor lange-termijn celculturen die een praktische methode voor de primaire celcultuur van mariene ongewervelde dieren17. Dit protocol combineerde en geoptimaliseerde ongewervelde celcultuur benadert en ontwikkelde een breed passende primaire kweekmethode voor zeekomkommer of andere ongewervelde zeedieren.
Apoptosis is een intrinsieke cel Suicide programma getriggerd door verschillende exogene en endogene stimuli. Gecoördineerde apoptosis is cruciaal voor veel biologische systemen18,19, en het is betrokken bij de intestinale regressie van zee komkommer tijdens aestivation9. Om het apoptotische proces in organismen van belang te onderzoeken, zijn een reeks methoden, waaronder Hoechst kleuring en microscopie testen, vastgesteld en met succes toegepast20. Hier, we voerden apoptosis inductie en detectie in primaire gekweekte intestinale cellen van zee komkommer om te beoordelen van de bruikbaarheid van primaire cellen in biologische studies van mariene ongewervelde dieren. Dexamethason, een van de meest gebruikte synthetische glucocorticosteroïden21, werd gebruikt voor het opwekken van Apoptosis in gekweekte darmcellen van zee komkommer, en significante Hoechst 33258 signaal werd met succes gedetecteerd in de bevlekte cellen door fluorescerende microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn uitgebreide onderzoeksinspanningen gewijd aan het tot stand brengen van cellijnen in de afgelopen decennia, maar het is nog steeds moeilijk om een vooruitgang te maken op lange termijn cultuur van cellen van mariene ongewervelde14,22. Er is gemeld dat gekweekte cellen van het regenereren van holothurian weefsels levensvatbaar voor een lange periode van tijd zijn en hoge activiteit van proliferatie kan worden gedetecteerd in specifieke cellen<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Prof. Naiming Zhou van de Zhejiang University bedanken voor zijn technisch advies en voor het beschikbaar stellen van de apparatuur van zijn laboratorium voor gebruik. Dit werk werd financieel gesteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie nummers 41876154, 41606150 en 41406137) en de fundamentele onderzoeksfondsen voor de Zhejiang provinciale universiteiten en onderzoeksinstituten [subsidie nummer 2019JZ00007 ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
