समुद्र ककड़ी आंतों की कोशिकाओं की एक प्राथमिक संस्कृति में एपोप्टोसिस प्रेरण और पता लगाने
Summary
यह प्रोटोकॉल समुद्री ककड़ी प्रेरित जापोन्कुस से आंतों की कोशिकाओं को संस्कृति के लिए एक आसान-से-हैंडल विधि प्रदान करता है और Echinodermata, मोलस्का और क्रस्टेसिया सहित समुद्री जीवों से विभिन्न व्यापक रूप से उपलब्ध ऊतक नमूनों के साथ संगत है।
Abstract
जैविक पदार्थों के कार्यात्मक मूल्यांकन या विशिष्ट जैविक गतिविधियों के लक्षण वर्णन के लिए असाधारण रूप से महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में विभिन्न वैज्ञानिक विषयों में प्राथमिक सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। हालांकि, सार्वभौमिक रूप से लागू सेल संस्कृति मीडिया और प्रोटोकॉल की कमी के कारण, समुद्री जीवों के लिए अच्छी तरह से वर्णित सेल संस्कृति विधियां अभी भी सीमित हैं। इस बीच, आमतौर पर होने वाली माइक्रोबियल संदूषण और समुद्री अकशेरुकी कोशिकाओं के पॉलीट्रोपिक गुण समुद्री अकशेरुकी के लिए एक प्रभावी सेल संस्कृति रणनीति की स्थापना में बाधा डालते हैं। यहां, हम समुद्री ककड़ी एपोस्टिचोपस जैपोनिकससे आंतों की कोशिकाओं को संजोने के लिए एक आसान-से-हैंडल विधि का वर्णन करते हैं; इसके अतिरिक्त, हम प्राथमिक सुसंस्कृत आंतों की कोशिकाओं में इन विट्रो एपोप्टोसिस इंडक्शन और डिटेक्शन का एक उदाहरण प्रदान करते हैं। इसके अलावा, यह प्रयोग उपयुक्त संस्कृति माध्यम और सेल संग्रह विधि के बारे में विवरण प्रदान करता है। वर्णित प्रोटोकॉल Echinodermata, Mollusca, और क्रस्टेसा सहित समुद्री जीवों से व्यापक रूप से उपलब्ध ऊतक नमूनों की एक किस्म के साथ संगत है, और यह कई इन विट्रो प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान कर सकते हैं । यह तकनीक शोधकर्ताओं को समुद्री अकशेरुकी से प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों में कुशलतापूर्वक हेरफेर करने और कोशिकाओं पर लक्षित जैविक सामग्रियों के कार्यात्मक मूल्यांकन को सुगम बनाने में सक्षम बनाएगी ।
Introduction
कृत्रिम रूप से नियंत्रित परिस्थितियों के तहत कोशिकाओं को संजोना, और उनके प्राकृतिक वातावरण में नहीं, जैविक अध्ययन के लिए एक समान प्रयोगात्मक सामग्री प्रदान करता है, विशेष रूप से प्रजातियों के लिए जिन्हें प्रयोगशाला के वातावरण में आसानी से सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। समुद्री अकशेरुकी सभी पशु प्रजातियों के 30% से अधिक के लिए खातेहैं,और वे पुनर्जनन2,3,तनाव प्रतिक्रिया4,और पर्यावरण अनुकूलन5,6के रूप में विशिष्ट जैविक प्रक्रियाओं के नियामक तंत्र पर अनुसंधान शुरू करने के लिए कई जैविक सामग्री प्रदान करते हैं ।
समुद्री ककड़ी, पोस्टिचोपस जैपोन्कुस,उत्तरी प्रशांत तट के साथ शीतोष्ण जल में रहने वाली सबसे अधिक अध्ययन की जाने वाली echinoderm प्रजातियों में से एक है। यह एक व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों के रूप में जाना जाता है और पूर्वी एशिया में बड़े पैमाने पर, विशेष रूप सेचीन7 में मारीकल्चर किया जाता है। ए जैपोनिक सहित ए जैपोनिकसके बारे में कई वैज्ञानिक प्रश्न, जिनमें एस्टिजन8 के बाद आंतों के उत्थान में अंतर्निहित नियामक तंत्र और एस्टिवेशन9में पतन, मेटाबोलिक नियंत्रण10,11,और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया12,13 थर्मल या रोगजनक तनावके तहत, शोधकर्ताओं का ध्यान आकर्षित किया है। हालांकि, अच्छी तरह से अध्ययन मॉडल जानवरों के साथ तुलना में, बुनियादी अनुसंधान, विशेष रूप से सेलुलर स्तर पर, तकनीकी बाधाओं से सीमित है, जैसे उन्नत सेल संस्कृति विधियों की कमी के रूप में ।
शोधकर्ताओं ने सेल लाइनों की स्थापना के लिए बहुत प्रयास समर्पित किया है, लेकिन वे भी कई चुनौतियों का सामना करना पड़ा है और किसी भी समुद्री अकशेरुकी से कोई सेल लाइन अभी तक14स्थापित किया गया है । हालांकि, समुद्री अकशेरुकी से प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों पिछले दशकों में उन्नतहै 15,16,और वे सेलुलर स्तर पर प्रयोग के लिए एक अवसर प्रदान की है । उदाहरण के लिए, ए जैपोन्यूस से पुनर्जीवित होने वाले इंटेसिन का उपयोग दीर्घकालिक कोशिका संस्कृतियों के लिए कोशिकाओं के स्रोत के रूप में किया गया है जिसने समुद्री अकशेरुकी17की प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए एक व्यावहारिक विधि प्रदान की। यह प्रोटोकॉल संयुक्त और अनुकूलित अकशेरुकी कोशिका संस्कृति दृष्टिकोण और समुद्री ककड़ी या अन्य समुद्री अकशेरुकी के लिए एक व्यापक रूप से उपयुक्त प्राथमिक संस्कृति विधि विकसित की है।
एपोप्टोसिस विभिन्न एक्सोजेनस और एंडोजेनस उत्तेजनाओं द्वारा शुरू किया गया एक आंतरिक सेल आत्महत्या कार्यक्रम है। समन्वित एपोप्टोसिस18,19कई जैविक प्रणालियों के लिए महत्वपूर्ण है और इसे एस्टिवेशन9के दौरान समुद्री ककड़ी के आंतों के प्रतिगमन में फंसाया गया है । ब्याज के जीवों में अपोप्टिक प्रक्रिया की जांच करने के लिए, Hoechst धुंधला और माइक्रोस्कोपी परख सहित तरीकों की एक श्रृंखला, स्थापित किया गया है और सफलतापूर्वक20लागू किया । यहां, हमने समुद्री अकशेरुकी के जैविक अध्ययन में प्राथमिक कोशिकाओं की उपयोगिता का आकलन करने के लिए समुद्री ककड़ी की प्राथमिक सुसंस्कृत आंतों की कोशिकाओं में एपोप्टोसिस इंडक्शन और डिटेक्शन का आयोजन किया। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले सिंथेटिक ग्लूकोकोटिकोस्टेरॉयड21में से एक, डेक्क्सेथेसोन का उपयोग समुद्री ककड़ी से सुसंस्कृत आंतों की कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए किया जाता था, और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा दागित कोशिकाओं में महत्वपूर्ण होईसीएसटी 33258 सिग्नल का सफलतापूर्वक पता लगाया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
व्यापक अनुसंधान प्रयास पिछले दशकों में सेल लाइनों की स्थापना के लिए समर्पित किया गया है, हालांकि, समुद्री अकशेरुकी14,22से कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति पर प्रगति करना अभी भी मुश…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक झेजियांग विश्वविद्यालय के प्रो निंगिंग झोउ को उनकी तकनीकी सलाह के लिए और अपनी प्रयोगशाला के उपकरणों को उपयोग के लिए उपलब्ध कराने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या ४१८७६१५४, ४१६०६१५०, और ४१४०६१३७) और झेजियांग प्रांतीय विश्वविद्यालयों और अनुसंधान संस्थानों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था [अनुदान संख्या २०१९JZ00007 ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
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