Apoptose induksjon og deteksjon i en primær kultur av Sea agurk intestinal celler
Summary
Denne protokollen gir en lett-å-håndtere metode for å kulturen i tarm celler fra havet agurk Apostichopus japonicus og er kompatibel med en rekke allment tilgjengelige vevsprøver fra Marine organismer, inkludert Echinodermata, Mollusca, og krepsdyr.
Abstract
Primære kultivert celler brukes i en rekke vitenskapelige disipliner som eksepsjonelt viktige verktøy for funksjonell evaluering av biologiske stoffer eller karakterisering av spesifikke biologiske aktiviteter. Men på grunn av mangelen på universelt gjeldende cellekultur Media og protokoller, godt beskrevet cellekultur metoder for Marine organismer er fortsatt begrenset. I mellomtiden, vanlig forekommende mikrobiell forurensning og polytropic egenskaper av marine virvelløse celler ytterligere hindre etablering av en effektiv cellekultur strategi for Marine virvelløse dyr. Her beskriver vi en lett-å-håndtere metode for dyrking intestinal celler fra havet agurk Apostichopus japonicus; i tillegg gir vi et eksempel på in vitro apoptose induksjon og deteksjon i primære kultivert tarm celler. Videre gir dette eksperimentet detaljer om riktig kultur medium og celle innsamlingsmetode. Den beskrevne protokollen er kompatibel med en rekke tilgjengelige vevsprøver fra Marine organismer, inkludert Echinodermata, Mollusca og krepsdyr, og den kan gi tilstrekkelige celler til flere in vitro-eksperimentelle applikasjoner. Denne teknikken vil gjøre forskerne i stand til å effektivt manipulere primær cellekulturer fra Marine virvelløse dyr og for å lette den funksjonelle evalueringen av målrettede biologiske materialer på celler.
Introduction
Dyrking celler under kunstig kontrollerte forhold, og ikke i sitt naturlige miljø, gir ensartet eksperimentelle materialer for biologiske studier, spesielt for arter som ikke kan lett kultivert i et laboratoriemiljø. Marine virvelløse dyr utgjør mer enn 30% av alle dyrearter1, og de gir mange biologiske materialer for å gjennomføre forskning på regulatoriske mekanismer for spesifikke biologiske prosesser, for eksempel regenerering2,3, stress respons4, og miljø tilpasning5,6.
Havet agurk, Apostichopus japonicus, er en av de mest studerte echinoderm arter bor tempererte farvann langs nord-Stillehavet kysten. Det er velkjent som en kommersielt viktig Art og maricultured i stor skala i Øst-Asia, spesielt i Kina7. Tallrike vitenskapelige spørsmål om A. japonicus, inkludert regulatoriske mekanismer underliggende intestinal regenerering etter evisceration8 og degenerasjon i aestivation9, metabolsk kontroll10,11, og immunrespons12,13 under termisk eller patogene påkjenninger, har tiltrukket seg oppmerksomheten til forskere. Men sammenlignet med godt studert modell dyr, grunnleggende forskning, spesielt på cellenivå, er begrenset av tekniske flaskehalser, for eksempel mangelen på avanserte cellekultur metoder.
Forskere har viet mye arbeid med å etablere cellelinjer, men de har også møtt mange utfordringer og ingen cellelinje fra noen Marine virvelløse har blitt etablert ennå14. Imidlertid har primær cellekulturer fra Marine virvelløse dyr Avansert i siste ti år15,16, og de har gitt en mulighet for eksperimentering på cellenivå. For eksempel har regenererende intesine fra A. japonicus blitt utnyttet som en kilde til celler for langsiktige cellekulturer som ga en praktisk metode for primær cellekultur av marine virvelløse dyr17. Denne protokollen kombinert og optimalisert virvelløse cellekultur tilnærminger og utviklet en allment egnet primær kultur metode for sjø agurk eller andre marine virvelløse dyr.
Apoptose er en iboende celle selvmords program utløst av ulike eksogene og endogene stimuli. Koordinert apoptose er avgjørende for mange biologiske systemer18,19, og det har vært innblandet i intestinal regresjon av havet agurk under aestivation9. For å undersøke apoptotisk prosessen i organismer av interesse, er en rekke metoder, inkludert Hoechst farging og mikroskopi analyser, etablert og hell brukt20. Her gjennomførte vi apoptose induksjon og deteksjon i primære kultivert tarm celler av havet agurk å vurdere brukbarheten av primær celler i biologiske studier av marine virvelløse dyr. Deksametason, en av de mest brukte syntetiske glukokortikosteroider21, ble brukt til å indusere apoptose i kulturperler tarm celler fra havet agurk, og signifikant Hoechst 33258 signal ble oppdaget i farget celler av fluorescerende mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omfattende forskningsarbeid har vært viet til å etablere cellelinjer i siste ti år, men det er fortsatt vanskelig å gjøre en fremgang på langsiktig kultur av celler fra Marine virvelløse dyr14,22. Det har blitt rapportert at kultivert celler fra regenererende holothurian vev var levedyktig i en lengre periode og høy aktivitet av spredning kan påvises i bestemte celler17,23. Men for normal Marine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Prof Naiming Zhou fra Zhejiang University for hans tekniske råd og for å gjøre utstyret av hans laboratorium tilgjengelig for bruk. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av National Natural Science Foundation i Kina (gi tall 41876154, 41606150 og 41406137) og de grunnleggende forskningsmidler for Zhejiang Provincial universiteter og forskningsinstitutter [gi nummer 2019JZ00007 ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
