Апоптоз индукции и обнаружения в начальной культуре морских огурцов кишечных клеток
Summary
Этот протокол обеспечивает простой в обращении метод культуры кишечных клеток из морского огурца Apostichopus japonicus и совместим с различными широко доступными образцами тканей морских организмов, включая Эхинодермата, Моллюскуску и Раккусею.
Abstract
Первичные культивированные клетки используются в различных научных дисциплинах в качестве исключительно важных инструментов для функциональной оценки биологических веществ или характеристики конкретных биологических видов деятельности. Однако из-за отсутствия универсально применимых средств массовой информации и протоколов клеточной культуры хорошо описанные методы клеточной культуры для морских организмов по-прежнему ограничены. Между тем, часто происходящее микробное загрязнение и политропные свойства морских беспозвоночных клеток еще больше препятствуют выработке эффективной стратегии клеточной культуры для морских беспозвоночных. Здесь мы описываем простой в обращении метод культивирования кишечных клеток из морского огурца Apostichopus japonicus; кроме того, мы предоставляем пример индукции in vitro apoptosis и обнаружения в первичных культивированных кишечных клетках. Кроме того, этот эксперимент содержит подробную информацию о соответствующем методе культуры и собираемости клеток. Описанный протокол совместим с различными широко доступными образцами тканей морских организмов, включая Эхинодермата, Моллюскусу и Раккуза, и может обеспечить достаточное количество клеток для нескольких экспериментальных применений in vitro. Этот метод позволит исследователям эффективно манипулировать первичными культурами клеток из морских беспозвоночных и облегчить функциональную оценку целевых биологических материалов на клетках.
Introduction
Культивирование клеток в искусственно контролируемых условиях, а не в их естественной среде, обеспечивает единые экспериментальные материалы для биологических исследований, особенно для видов, которые не могут быть легко культивированы в лабораторных условиях. Морские беспозвоночные составляют более 30% всех видов животных1,и они обеспечивают многочисленные биологические материалы для проведенияисследований по регулирующим механизмам конкретных биологических процессов, таких как регенерация2,3,стресс ответ 4 , и экологическая адаптация5,6.
Морской огурец, Apostichopus japonicus, является одним из наиболее изученных видов эхинодерм, населяющих умеренные воды вдоль побережья Северной Части Тихого океана. Он хорошо известен как коммерчески важные виды и maricultured в больших масштабах в Восточной Азии, особенно в Китае7. Многочисленные научные вопросы, касающиеся A. japonicus, в том числе регулятивных механизмов, лежащих в основе кишечной регенерации после потрошивания8 и дегенерации в эстивации9,метаболический контроль10,11, и иммунный ответ12,13 под тепловой или патогенных стрессов, привлекли внимание исследователей. Однако, по сравнению с хорошо изученными модельными животными, фундаментальные исследования, особенно на клеточном уровне, ограничены техническими узкими местами, такими как отсутствие передовых методов клеточной культуры.
Исследователи посвятили много усилий для установления клеточных линий, но они также столкнулись со многими проблемами, и ни одна клеточная линия от любого морского беспозвоночного была создана еще14. Тем не менее, первичные клеточные культуры морских беспозвоночных продвинулись в последние десятилетия15,16, и они предоставили возможность для экспериментов на клеточном уровне. Например, регенерирующий интезин от A. japonicus был использован в качестве источника клеток для долгосрочных клеточных культур, которые предоставили практический метод для первичной клеточной культуры морских беспозвоночных17. Этот протокол объединил и оптимизировал культуру беспозвоночных клеток и разработал широко подходящий метод первичной культуры для морских огурцов или других морских беспозвоночных.
Апоптоз является внутренней программы самоубийства клетки вызваны различными экзогенными и эндогенными стимулами. Скоординированный апоптоз имеет решающее значение для многих биологических систем18,19, и он был вовлечен в кишечной регрессии морского огурца во время aestivation9. Для исследования апоптотический процесс в организмах, представляющих интерес, ряд методов, в том числе Hoechst окрашивания и микроскопических анализов, были созданы и успешно применяются20. Здесь мы провели индукцию апоптоза и выявление в первичных культивированных кишечных клетках морского огурца для оценки удобства использования первичных клеток в биологических исследованиях морских беспозвоночных. Дексаметазон, один из широко используемых синтетических глюкокортикостероидов21, был использован для индуцирования апоптоза в культивированных кишечных клетках из морского огурца, и значительный сигнал Hoechst 33258 был успешно обнаружен в окрашенных клетках флуоресцентной микроскопией.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обширные исследовательские усилия были посвящены созданию клеточных линий в последние десятилетия, однако, по-прежнему трудно добиться прогресса в долгосрочной культуре клеток из морских беспозвоночных14,22. Было сообщено, что культивированные клетки и?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить профессора Наиджина Чжоу из Университета Чжэцзян за его технические рекомендации и за то, что он сделал оборудование его лаборатории доступным для использования. Эта работа была финансово поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант номера 41876154, 41606150, и 41406137) и фундаментальных научно-исследовательских фондов для чжэцзян провинциальных университетов и научно-исследовательских институтов (грант номер 2019J’00007) ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
