Inducción y detección de apoptosis en un cultivo primario de células intestinales de pepino marino
Summary
Este protocolo proporciona un método fácil de manejar para cultivar las células intestinales del pepino de mar Apostichopus japonicus y es compatible con una variedad de muestras de tejido ampliamente disponibles de organismos marinos, incluyendo Echinodermata, Mollusca y Crustacea.
Abstract
Las células cultivadas primarias se utilizan en una variedad de disciplinas científicas como herramientas excepcionalmente importantes para la evaluación funcional de sustancias biológicas o la caracterización de actividades biológicas específicas. Sin embargo, debido a la falta de medios y protocolos de cultivo celular universalmente aplicables, los métodos de cultivo celular bien descritos para los organismos marinos siguen siendo limitados. Mientras tanto, la contaminación microbiana y las propiedades politrópicas de las células invertebradas marinas impiden aún más el establecimiento de una estrategia de cultivo celular eficaz para los invertebrados marinos. Aquí, describimos un método fácil de manejar para el cultivo de células intestinales de pepino de mar Apostichopus japonicus; además, proporcionamos un ejemplo de inducción y detección de apoptosis in vitro en células intestinales cultivadas primarias. Además, este experimento proporciona detalles sobre el medio de cultivo adecuado y el método de colección de células. El protocolo descrito es compatible con una variedad de muestras de tejido ampliamente disponibles de organismos marinos, incluyendo Echinodermata, Mollusca y Crustacea, y puede proporcionar suficientes células para múltiples aplicaciones experimentales in vitro. Esta técnica permitiría a los investigadores manipular eficientemente los cultivos celulares primarios de los invertebrados marinos y facilitar la evaluación funcional de materiales biológicos específicos en las células.
Introduction
El cultivo de células en condiciones controladas artificialmente, y no en su entorno natural, proporciona materiales experimentales uniformes para estudios biológicos, especialmente para especies que no se pueden cultivar fácilmente en un entorno de laboratorio. Los invertebrados marinos representan más del 30% de todas las especies animales1y proporcionan numerosos materiales biológicos para llevar a cabo investigaciones sobre los mecanismos reguladores de procesos biológicos específicos, como la regeneración2,3, la respuesta al estrés4,y la adaptación ambiental5,6.
El pepino de mar, Apostichopus japonicus,es una de las especies de equinodermos más estudiadas que habita en aguas templadas a lo largo de la costa del Pacífico Norte. Es bien conocido como una especie comercialmente importante y maricultura a gran escala en Asia oriental, especialmente en China7. Numerosas preguntas científicas sobre A. japonicus,incluyendo los mecanismos reguladores subyacentes a la regeneración intestinal después de la evisceración8 y la degeneración en la estivación9, el control metabólico10,11,y la respuesta inmune12,13 bajo tensiones térmicas o patógenas, han atraído la atención de los investigadores. Sin embargo, en comparación con los animales modelo bien estudiados, la investigación básica, especialmente a nivel celular, está limitada por cuellos de botella técnicos, como la falta de métodos avanzados de cultivo celular.
Los investigadores han dedicado mucho esfuerzo al establecimiento de líneas celulares, pero también se han enfrentado a muchos desafíos y no se ha establecido ninguna línea celular de ningún invertebrado marino todavía14. Sin embargo, los cultivos celulares primarios de los invertebrados marinos han avanzado en las últimas décadas15,16,y han proporcionado una oportunidad para la experimentación a nivel celular. Por ejemplo, la intesina regeneradora de A. japonicus se ha utilizado como una fuente de células para cultivos celulares a largo plazo que proporcionó un método práctico para el cultivo celular primario de invertebrados marinos17. Este protocolo combina y optimizó el cultivo celular de invertebrados y desarrolló un método de cultivo primario ampliamente adecuado para pepino de mar u otros invertebrados marinos.
La apoptosis es un programa de suicidio celular intrínseco desencadenado por varios estímulos exógenos y endógenos. La apoptosis coordinada es crucial para muchos sistemas biológicos18,19,y se ha implicado en la regresión intestinal del pepino de mar durante la estivación9. Para investigar el proceso apoptotico en organismos de interés, se han establecido y aplicado con éxito una serie de métodos, incluidos ensayos de tinción y microscopía Hoechst, que se han aplicado con éxito20. Aquí, llevamos a cabo la inducción y detección de apoptosis en células intestinales cultivadas primarias de pepino de mar para evaluar la usabilidad de las células primarias en estudios biológicos de invertebrados marinos. La dexametasona, uno de los glucocorticosteroides sintéticos de uso común21,se utilizó para inducir apoptosis en células intestinales cultivadas a partir de pepino de mar, y la señal significativa Hoechst 33258 se detectó con éxito en las células manchadas mediante microscopía fluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
En las últimas décadas se han dedicado amplios esfuerzos de investigación a establecer líneas celulares en las últimas décadas, sin embargo, sigue siendo difícil avanzar en el cultivo a largo plazo de células a partir de invertebrados marinos14,22. Se ha informado de que las células cultivadas de la regeneración de los tejidos holothurianos eran viables durante un largo período de tiempo y se puede detectar una alta actividad de proliferación en célu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer al profesor Naiming Zhou de la Universidad de Zhejiang por su asesoramiento técnico y por poner el equipo de su laboratorio a disposición para su uso. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 41876154, 41606150 y 41406137) y los Fondos De Investigación Fundamental para las Universidades e Institutos de Investigación Provinciales de Zhejiang [número de subvención 2019JZ00007 ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
