Deniz Hıyar Bağırsak Hücrelerinin Birincil Kültüründe Apoptosis İndüksiyon uyupve tayini
Summary
Bu protokol deniz hıyarı Apostichopus japonicus bağırsak hücreleri kültür için kolay bir yöntem sağlar ve Echinodermata, Mollusca ve Crustacea gibi deniz organizmalarından yaygın olarak kullanılabilir doku örnekleri çeşitli ile uyumludur.
Abstract
Birincil kültür hücreleri biyolojik maddelerin fonksiyonel değerlendirilmesi veya belirli biyolojik faaliyetlerin karakterizasyonu için son derece önemli araçlar olarak bilimsel disiplinlerde çeşitli kullanılır. Ancak, evrensel olarak uygulanabilir hücre kültürü medya ve protokollerin eksikliği nedeniyle, deniz canlıları için iyi tanımlanmış hücre kültürü yöntemleri hala sınırlıdır. Bu arada, deniz omurgasız hücrelerinin yaygın olarak meydana gelen mikrobiyal kontaminasyon ve politropik özellikleri deniz omurgasızlar için etkili bir hücre kültürü stratejisinin kurulmasını engeller. Burada, deniz hıyarı Apostichopus japonicusbağırsak hücrelerini culturing için kolay bir yöntem işlemek için açıklar; ayrıca, birincil kültürbağırsak hücrelerinde in vitro apoptosis indüksiyon ve saptama bir örnek sağlar. Ayrıca, bu deneme uygun kültür orta ve hücre toplama yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Açıklanan protokol, Echinodermata, Mollusca ve Crustacea gibi deniz organizmalarından alınan çeşitli yaygın doku örnekleri ile uyumludur ve birden fazla in vitro deneysel uygulama için yeterli hücre sağlayabilir. Bu teknik, araştırmacıların deniz omurgasızlarından birincil hücre kültürlerini verimli bir şekilde manipüle etmelerini ve hücreler üzerindeki hedeflenen biyolojik maddelerin işlevsel değerlendirmesini kolaylaştırmasını sağlayacaktır.
Introduction
Hücreleri doğal ortamlarında değil, yapay olarak kontrol edilen koşullarda, biyolojik çalışmalar için, özellikle de laboratuvar ortamında kolayca kültürlendirileemeyen türler için tek tip deneysel malzemeler sağlar. Deniz omurgasızlar tüm hayvan türlerinin % 30’undan fazlasını oluştururlar1, ve rejenerasyon2,3,stres tepkisi4ve çevresel adaptasyon5,6gibi belirli biyolojik süreçlerin düzenleyici mekanizmaları üzerinde araştırma üstlenmek için çok sayıda biyolojik malzeme sağlarlar.
Deniz hıyarı, Apostichopus japonicus, Kuzey Pasifik kıyıları boyunca ılıman sularda yaşayan en çok çalışılan echinoderm türlerinden biridir. Bu iyi ticari olarak önemli bir tür olarak bilinir ve Doğu Asya’da büyük bir ölçekte maricultured, ÖzellikleÇin’de 7. A. japonicusile ilgili çok sayıda bilimsel soru , evisceration sonra bağırsak rejenerasyon u yatan düzenleyici mekanizmalar dahil8 ve aestivationdejenerasyon 9, metabolik kontrol10,11, ve bağışıklık yanıtı12,13 termal veya patojenik stresaltında, araştırmacıların dikkatini çekmiştir. Ancak, iyi çalışılmış model hayvanlarile karşılaştırıldığında, temel araştırma, özellikle hücresel düzeyde, teknik darboğazları ile sınırlıdır, gelişmiş hücre kültürü yöntemlerinin eksikliği gibi.
Araştırmacılar hücre hatları oluşturmak için çok çaba ayrılmış, ama onlar da birçok zorluklarla karşı karşıya kalmıştır ve herhangi bir deniz omurgasız hiçbir hücre hattı henüz kurulmuştur14. Ancak, deniz omurgasızların birincil hücre kültürleri son yıllarda gelişmiş15,16, ve hücresel düzeyde deney için bir fırsat sağlamıştır. Örneğin, A. japonicus’un rejeneratif intesini, deniz omurgasızlarının birincil hücre kültürü için pratik bir yöntem sağlayan uzun süreli hücre kültürleri için hücre kaynağı olarak kullanılmıştır17. Bu protokol omurgasız hücre kültürü yaklaşımlarını birleştirmiş ve optimize etmiş ve deniz hıyarı veya diğer deniz omurgasızları için çok uygun bir birincil kültür yöntemi geliştirmiştir.
Apoptosis çeşitli eksojen ve endojen uyaranlar tarafından tetiklenen bir içsel hücre intihar programıdır. Koordine apoptosis birçok biyolojik sistemler için çok önemlidir18,19, ve aestivation sırasında deniz hıyarı bağırsak regresyonu karıştığı olmuştur9. İlgi çeken organizmalarda apoptotik süreci araştırmak için, Hoechst boyama ve mikroskopi tahlilleri de dahil olmak üzere bir dizi yöntem kurulmuş ve başarıylauygulanmıştır 20. Burada deniz omurgasızlarının biyolojik çalışmalarında birincil hücrelerin kullanılabilirliğini değerlendirmek için deniz hıyarı primer kültürlü bağırsak hücrelerinde apoptosis indüksiyonu ve tespiti gerçekleştirdik. Deksametazon, yaygın olarak kullanılan sentetik glukokortikosteroidler21,deniz hıyar kültürlü bağırsak hücrelerinde apoptoz neden olarak kullanılan, ve önemli Hoechst 33258 sinyal floresan mikroskoposkopi ile lekeli hücrelerde başarıyla tespit edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kapsamlı araştırma çabaları son yıllarda hücre hatları kurmaya ayrılmış, ancak, hala deniz omurgasızlar14,22hücrelerin inuzun uzun vadeli kültür üzerinde bir ilerleme yapmak zordur. Bu rejenerasyon holotoryian dokulardan kültürlü hücrelerin uzun bir süre için canlı olduğu bildirilmiştir ve çoğalma yüksek aktivite belirli hücrelerde tespit edilebilir17,23. Ancak, normal deniz o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Zhejiang Üniversitesi’nden Prof. Naiming Zhou’ya teknik tavsiyeleri ve laboratuvarının ekipmanını kullanıma hazır hale getirmeleri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 41876154, 41606150 ve 41406137) ve Zhejiang İl Üniversiteleri ve Araştırma Enstitüleri Için Temel Araştırma Fonları [hibe numarası 2019JZ00007) tarafından finansal olarak desteklenmiştir. ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
